Merci fir besicht Nature.com.Dir benotzt eng Browser Versioun mat limitéierter CSS Ënnerstëtzung.Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten).Zousätzlech, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, weisen mir de Site ouni Stiler a JavaScript.
Sliders déi dräi Artikelen pro Rutsch weisen.Benotzt d'Réck- an d'nächst Knäppercher fir duerch d'Rutschen ze réckelen, oder d'Slide Controller Knäppercher um Enn fir duerch all Rutsch ze réckelen.

317 STAINLESS Stol coil tubing Fournisseuren

Chemesch Zesummesetzung Dësch vun STAINLESS Stol Material

SPACA6 ass e Spermien ausgedréckt Uewerflächeprotein dat kritesch ass fir Gamete Fusioun wärend der sexueller Reproduktioun vu Mamendéieren.Trotz dëser fundamentaler Roll ass d'spezifesch Funktioun vu SPACA6 schlecht verstanen.Mir klären d'Kristallstruktur vum extrazelluläre Domain vu SPACA6 bei enger Resolutioun vun 2,2 Å, enthüllt en Zwee-Domain-Protein, deen aus engem véiersträifend Bündel an Ig-ähnlechen β-Sandwichen zesummegesat ass mat quasi-flexibele Linker.Dës Struktur gläicht IZUMO1, en anert Gamete Fusioun-assoziéiert Protein, wat SPACA6 an IZUMO1 Grënnungsmembere vun der Superfamily vun Befruchtungsassoziéierte Proteinen mécht, déi hei als IST Superfamily bezeechent gëtt.D'IST Superfamily ass strukturell definéiert duerch säi verdrësselten Véierhelix Bündel an e Paar Disulfid-verbonne CXXC Motiver.Eng Struktur-baséiert AlphaFold Sich vun der mënschlecher proteome identifizéiert zousätzlech Protein Memberen vun dëser superfamily;notamment, vill vun dëse Proteinen sinn an Gamete Fusioun involvéiert.D'SPACA6 Struktur a seng Relatioun zu anere Membere vun der IST Superfamily liwweren de fehlende Link an eisem Wëssen vun der Mamendéieren Gamete Fusioun.
All Mënschlecht Liewen fänkt mat zwee getrennten haploid Gameten un: dem Papp säi Spermien an dem Ee vun der Mamm.Dëse Spermien ass de Gewënner vun engem intensiven Selektiounsprozess, wärend Millioune Spermienzellen duerch de weibleche Genitaltrakt passéieren, verschidde Hindernisser1 iwwerwannen a Kapazitéit erliewen, wat hir Motilitéit an de Prozess vun Uewerflächekomponenten2,3,4 verbessert.Och wann d'Spermien an d'Oocyte sech fannen, ass de Prozess nach net eriwwer.D'Oocyt ass ëmgi vun enger Schicht vu Cumuluszellen an enger Glykoproteinbarriär genannt Zona pellucida, duerch déi Spermien musse passéieren fir an d'Oocyte anzeginn.Spermatozoa benotzen eng Kombinatioun vun Uewerflächenadhäsiounsmoleküle a Membran-assoziéierten a secretéierten Enzyme fir dës lescht Barrièren ze iwwerwannen5.Dës Molekülen an Enzyme ginn haaptsächlech an der banneschter Membran an der akrosomaler Matrix gelagert a ginn festgestallt wann déi baussenzeg Membran vum Spermien während der akrosomaler Reaktioun lyséiert gëtt6.De leschte Schrëtt an dëser intensiver Rees ass de Sperma-Ee Fusiounsevenement, an deem déi zwou Zellen hir Membranen fusionéieren fir en eenzegen diploiden Organismus ze ginn7.Och wann dëse Prozess banebriechend an der mënschlecher Reproduktioun ass, sinn déi néideg molekulare Interaktioune schlecht verstanen.
Zousätzlech zu der Befruchtung vu Gameten ass d'Chemie vun der Fusioun vun zwee Lipid-Bilayer extensiv studéiert.Allgemeng ass d'Membranfusioun en energesch unfavorable Prozess deen e Proteinkatalysator erfuerdert fir eng strukturell Konformatiounsännerung z'ënnerhalen, déi zwou Membranen méi no zesummen bréngt, hir Kontinuitéit briechen a Fusioun verursaachen8,9.Dës Protein Katalysatoren sinn als Fusogene bekannt a goufen an enger Onmass Fusiounssystemer fonnt.Si sinn erfuerderlech fir viral Entrée an Hostzellen (zB gp160 bei HIV-1, Spike bei Coronavirussen, Hämagglutinin bei Grippeviren) 10,11,12 placental (Syncytin) 13,14,15 a gamete-formende Fusioune bei ënneschten Eukaryoten ( HAP2 / GCS1 a Planzen, Protisten an Arthropoden) 16,17,18,19.Fusogens fir mënschlech Gameten mussen nach entdeckt ginn, obwuel verschidde Proteine ​​kritesch gewise gi sinn fir Gamete Uschloss a Fusioun.D'oocyte-ausgedréckt CD9, engem transmembrane Protein néideg fir d'Fusioun vun Maus a mënschlech gametes, war déi éischt entdeckt 21,22,23.Obwuel seng präzis Funktioun onkloer bleift, eng Roll an Haftung, der Struktur vun Haftung Foci op Ee microvilli, an / oder déi richteg Lokalisatioun vun oocyte Uewerfläch Proteinen schéngt wahrscheinlech 24,25,26.Déi zwee typesch Proteinen déi kritesch sinn fir Gamete Fusioun sinn de Spermienprotein IZUMO127 an den Oocyte Protein JUNO28, an hir géigesäiteg Associatioun ass e wichtege Schrëtt an der Gamete Unerkennung an Adhäsioun virun der Fusioun.Männlech Izumo1 Knockout Mais a weiblech Juno Knockout Mais si komplett steril, an dëse Modeller ginn Spermien an de Perivitelline Raum awer Gameten fusionéieren net.Ähnlech gouf d'Konfluenz reduzéiert wann d'Gameten mat Anti-IZUMO1 oder JUNO27,29 Antikörper bei mënschlechen In vitro Befruchtungsexperimenter behandelt goufen.
Viru kuerzem ass eng nei entdeckt Grupp vu Spermien ausgedréckt Proteinen phenotypesch ähnlech wéi IZUMO1 a JUNO20,30,31,32,33,34,35 entdeckt ginn.Sperm acrosomal Membran-assoziéiert Protein 6 (SPACA6) gouf als essentiell fir Befruchtung an enger grousser Mutagenesestudie identifizéiert.D'Insertioun vum Transgen an de Spaca6-Gen produzéiert nonfusible Spermatozoa, obwuel dës Spermatozoen de Perivitelline Raum 36 infiltréieren.Spéider Knockout Studien bei Mais bestätegt datt Spaca6 fir Gamete Fusioun 30,32 erfuerderlech ass.SPACA6 gëtt bal ausschliesslech an den Hoden ausgedréckt an huet e Lokalisatiounsmuster ähnlech wéi dee vun IZUMO1, nämlech bannent der Intima vun de Spermatozoa virun der acrosomaler Reaktioun, a migréiert dann an d'equatorial Regioun no der acrosomaler Reaktioun 30,32.Spaca6 Homologen existéieren an enger Vielfalt vu Mamendéieren an aner Eukaryoten 30 a seng Wichtegkeet fir mënschlech Gametefusioun gouf duerch Inhibitioun vun der mënschlecher Befruchtung in vitro duerch Resistenz géint SPACA6 30 bewisen.Am Géigesaz zu IZUMO1 a JUNO bleiwen d'Detailer vun der Struktur, Interaktiounen a Funktioun vu SPACA6 onkloer.
Fir de fundamentale Prozess besser ze verstoen, deen d'Fusioun vu mënschleche Spermien an Eeër ënnersträicht, wat eis erlaabt zukünfteg Entwécklungen an der Familljeplanung an der Fruchtbarkeetbehandlung z'informéieren, hu mir SPACA6 strukturell a biochemesch Studien gemaach.D'Kristallstruktur vum extrazelluläre Domain vu SPACA6 weist e véier-helical Bündel (4HB) an en Immunoglobulin-ähnlechen (Ig-ähnlechen) Domain verbonne mat quasi-flexibele Regiounen.Wéi virausgesot a fréiere Studien, 7,32,37 ass d'Domainstruktur vu SPACA6 ähnlech wéi déi vum mënschleche IZUMO1, an déi zwee Proteine ​​​​deelen en ongewéinleche Motiv: 4HB mat enger dräieckeger helical Uewerfläch an e Paar Disulfid-verbonne CXXC Motiver.Mir proposéieren datt IZUMO1 an SPACA6 elo eng méi grouss, strukturell Zesummenhang Superfamily vu Proteinen definéieren, déi mat Gamete Fusioun assoziéiert sinn.Mat Features eenzegaarteg fir d'Superfamily hu mir eng ustrengend Sich no dem AlphaFold strukturelle mënschleche Proteom gemaach, zousätzlech Membere vun dëser Superfamilie z'identifizéieren, dorënner verschidde Memberen, déi an der Gametefusioun an/oder Befruchtung involvéiert sinn.Et schéngt elo datt et e gemeinsame strukturelle Falt an Superfamily vu Proteinen ass, déi mat Gamete Fusioun assoziéiert ass, an eis Struktur bitt eng molekulare Kaart vun dësem wichtegen Aspekt vum mënschleche Gamete Fusiounsmechanismus.
SPACA6 ass en Single-Pass Transmembranprotein mat engem N-verbonne Glykan a sechs putative Disulfidbindungen (Figuren S1a a S2).Mir ausgedréckt der extracellular Domain vun mënschlech SPACA6 (Reschter 27-246) zu Drosophila S2 Zellen a gereinegt d'Protein Néckel Affinitéit benotzt, Cation Austausch, a Gréisst Exklusioun chromatography (Figebam. S1b).De gereinegt SPACA6 Ectodomain ass ganz stabil an homogen.Analyse mat Gréisst Ausgrenzung chromatography kombinéiert mat polygonal Liichtjoer Streuung (SEC-MALS) réischt ee Biergspëtzten mat engem berechent molekulare Gewiicht vun 26,2 ± 0,5 kDa (Lalumi S1c).Dëst ass konsequent mat der Gréisst vum SPACA6 monomere Ektodomain, wat beweist datt d'Oligomeriséierung net während der Reinigung geschitt ass.Zousätzlech, kreesfërmeg dichroism (CD) Spektroskopie réischt eng gemëscht α /β Struktur mat engem Schmelzpunkt vun 51,3 ° C (Figebam. S1d, e).Deconvolution vun der CD Spektrum réischt 38,6% α-helical an 15,8% β-gestrengt Elementer (Dorënner S1d).
D'SPACA6 ectodomain war mat zoufälleg Matrixentgasung seeding38 crystallized doraus an engem Datesaz mat enger Resolutioun vun 2,2 Å (Table 1 an Dorënner S3).Mat enger Kombinatioun vu Fragment-baséiert molekulare Substitutioun a SAD Phasingdaten mat Bromidbelaaschtung fir Strukturbestëmmung (Table 1 a Figure S4), besteet de final raffinéierte Modell aus Reschter 27-246.Zu där Zäit wou d'Struktur bestëmmt gouf, waren et keng experimentell oder AlphaFold Strukturen verfügbar.De SPACA6 Ectodomain moosst 20 Å × 20 Å × 85 Å, besteet aus siwen Helices an néng β-Stränn, an huet e verlängerten tertiäre Falt stabiliséiert vu sechs Disulfidbindungen (Fig. 1a, b).Déi schwaach Elektronendicht um Enn vun der Asn243 Säitkette weist datt dëse Rescht eng N-verbonne Glykosylatioun ass.D'Struktur besteet aus zwee Domänen: en N-terminal Véier-Helix-Bündel (4HB) an e C-terminal Ig-ähnlechen Domain mat enger Zwëschenscharnéierregioun tëscht hinnen (Fig. 1c).
eng Struktur vum extrazelluläre Domain vu SPACA6.Stripdiagramm vum extrazelluläre Domain vu SPACA6, d'Faarf vun der Kette vun N bis C-Terminus vun donkelblo bis donkelrout.Cysteine ​​involvéiert an Disulfidbindungen ginn a Magenta beliicht.b Topologie vum extrazelluläre Domain vu SPACA6.Benotzt déiselwecht Faarfschema wéi an der Figur 1a.c SPACA6 extrazellulär Domain.D'4HB, Scharnier, an Ig-ähnlech Domain Strip Charts si faarweg orange, gréng a blo, respektiv.D'Schichten ginn net op Skala gezeechent.
D'4HB Domain vun SPACA6 ëmfaasst véier Haapt Helices (Helices 1-4), déi an der Form vun engem helical Helix arrangéiert sinn (Fig. 2a), alternéierend tëscht antiparallel a parallel Interaktiounen (Fig. 2b).Eng kleng zousätzlech Single-Wend Helix (Helikus 1′) gëtt senkrecht zum Bündel geluecht, en Dräieck mat Helixen 1 an 2 bilden. Abb. 2a).
4HB N-terminal Strip Chart.b Top Vue vun engem Bündel vu véier Helixen, all Helix beliicht an donkelblo um N-Terminus an donkelrout um C-Terminus.c Top-down Spiralraddiagramm fir 4HB, mat all Rescht gezeechent als Krees mat engem eenzege Bréif Aminosaier Code;nëmmen déi véier Aminosäuren um Top vun der Rad sinn nummeréiert.Net-polare Reschter si giel faarweg, polar ongelueden Reschter si gréng faarweg, positiv gelueden Reschter si blo faarweg, an negativ gelueden Reschter si rout faarweg.d Dräieckeg Gesiichter vum 4HB Domain, mat 4HBs an orange a Scharnéier a gréng.Béid Insets weisen stavförmlech Disulfidbindungen.
4HB ass op en banneschten hydrophobesche Kär konzentréiert, deen haaptsächlech aus alifateschen an aromatesche Reschter besteet (Fig. 2c).De Kär enthält eng Disulfidbindung tëscht Cys41 an Cys55, déi d'Heliken 1 an 2 zesummen an engem ieweschten opgehuewe Dräieck verbënnt (Fig. 2d).Zwou zousätzlech disulfide Obligatiounen sech tëscht dem CXXC Motiv zu Helix 1 'an aner CXXC Motiv um Tipp vun der β-hairpin am Scharnier Regioun fonnt (Figebam. 2d).E konservativen Argininreschter mat enger onbekannter Funktioun (Arg37) läit an engem huel Dräieck geformt duerch Helices 1', 1 an 2. Aliphatesch Kuelestoffatome Cβ, Cγ a Cδ Arg37 interagéieren mam hydrophobesche Kär, a seng Guanidingruppen beweegen sech zyklesch. tëscht helices 1 'an 1 via Interaktiounen tëscht der Thr32 Réckemuerch an Säit Kette (Figebam. S5a, b).Tyr34 erstreckt sech an d'Kavitéit a léisst zwee kleng Huelraim duerch déi Arg37 mat dem Léisungsmëttel interagéiere kann.
Ig-ähnlech β-Sandwich-Domänen sinn eng grouss Superfamilie vu Proteinen, déi d'gemeinsame Feature vun zwee oder méi multi-stranded amphipathesche β-Placke deelen, déi iwwer e hydrophobesche Kär interagéieren 39. D'C-terminal Ig-ähnlech Domain vu SPACA6 huet datselwecht Muster a besteet aus zwee Schichten (Fig. S6a).Blat 1 ass e β-Blat vu véier Strécke (Sträng D, F, H, an I), wou Strécke F, H, an I eng anti-parallell Arrangement bilden, a Strécke I an D eng parallel Interaktioun ophuelen.Table 2 ass e klengt anti-parallel duebelstrengeg Beta-Blat (Stränn E a G).Eng intern disulfide Bond war tëscht dem C-terminus vun der E Kette an den Zentrum vun der H Kette (Cys170-Cys226) (Lalumi S6b) observéiert.Dës Disulfidbindung ass analog zu der Disulfidbindung am β-Sandwich Domain vum Immunoglobulin40,41.
D'Véierstrang β-Blat verdréit sech iwwer seng ganz Längt, a bilden asymmetresch Kanten, déi sech a Form an Elektrostatik ënnerscheeden.De méi dënnen Rand ass eng flaach hydrophobe Ëmweltfläch, déi am Verglach zu de verbleiwen ongläichen an elektrostatesch divers Flächen am SPACA6 erausstécht (Fig. S6b, c).A Halo vun ausgesat Réckemuerch carbonyl / Amino Gruppen a polare Säit Ketten ëmginn der hydrophobic Uewerfläch (Fig. S6c).Déi méi breet Marge gëtt vun engem capped helical Segment bedeckt, deen den N-terminalen Deel vum hydrophobesche Kär blockéiert an dräi Waasserstoffbindunge mat der oppener polare Grupp vun der F Kette Réckgrat bilden (Fig. S6d).Den C-terminalen Deel vun dësem Rand bildt eng grouss Tasche mat engem deelweis ausgesatem hydrophobesche Kär.D'Tasche ass vu positiven Ladungen ëmgi wéinst dräi Sätz vun duebelen Argininreschter (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 an Arg212-Arg214) an engem zentrale Histidin (His220) (Figure S6e).
D'Scharnierregioun ass e kuerze Segment tëscht dem spiraleschen Domän an dem Ig-ähnlechen Domain, besteet aus enger antiparalleller dräistrengeg β-Schicht (Stränn A, B a C), enger klenger 310 Helix, a verschidde laang zoufälleg helical Segmenter.(Fig. S7).E Netzwierk vu kovalente an elektrostatesche Kontakter an der Scharnéierregioun schéngt d'Orientéierung tëscht 4HB an dem Ig-ähnlechen Domain ze stabiliséieren.D'Netz kann an dräi Deeler opgedeelt ginn.Den éischten Deel enthält zwee CXXC-Motiver (27CXXC30 an 139CXXC142), déi e Paar Disulfidbindungen tëscht dem β-Hoerpin am Scharnier an der 1′ Helix am 4HB bilden.Den zweeten Deel enthält elektrostatesch Interaktiounen tëscht dem Ig-ähnlechen Domain an dem Scharnier.Glu132 am Scharnier bildt eng Salzbréck mat Arg233 am Ig-ähnlechen Domain an Arg135 am Scharnier.Den drëtten Deel enthält eng kovalent Verbindung tëscht dem Ig-ähnlechen Domain an der Scharnierregioun.Zwee Disulfidbindungen (Cys124-Cys147 an Cys128-Cys153) verbannen d'Scharnierschleife mat engem Linker, deen duerch elektrostatesch Interaktiounen tëscht Gln131 an der Funktionell Grupp vun der Réckgrat stabiliséiert gëtt, wat den Zougang zum éischten Ig-ähnlechen Domain erlaabt.Kette.
D'Struktur vun der SPACA6 ectodomain an eenzel Strukture vun 4HB an Ig-wëll Beräicher goufen benotzt fir strukturell ähnlech records an Protein Datenbanken 42 ze Sich.Mir identifizéiert Mätscher mat héich Dali Z Partituren, kleng Standarddeviatiounen, a grousse LALI Partituren (déi lescht ass d'Zuel vun strukturell gläichwäerteg Reschter).Wärend déi éischt 10 Treffer vun der voller Ectodomain Sich (Table S1) en akzeptablen Z-Score vun> 842 haten, huet eng Sich no 4HB oder Ig-ähnlechen Domain eleng gewisen datt déi meescht vun dësen Hits nëmme mat β-Sandwichen entspriechen.eng ubiquitär Fal déi a ville Proteinen fonnt gëtt.All dräi Recherchen am Dali hunn nëmmen ee Resultat zréckginn: IZUMO1.
Et gouf laang virgeschloen datt SPACA6 an IZUMO1 strukturell Ähnlechkeeten deelen7,32,37.Och wann d'Ectodomaine vun dësen zwee Gamete Fusioun-assoziéiert Proteinen nëmmen 21% Sequenzidentitéit deelen (Figure S8a), komplex Beweiser, dorënner e konservéiert Disulfidbindungsmuster an e virausgesot C-terminal Ig-ähnlechen Domain am SPACA6, erlaabt fréi Versuche fir eng Konservéierung ze bauen. homologie Modell vun A eng SPACA6 Maus benotzt IZUMO1 als Schabloun37.Eis Struktur bestätegt dës Prognosen a weist de richtege Grad vun Ähnlechkeet.Tatsächlech deelen d'SPACA6 an IZUMO137,43,44 Strukturen déiselwecht zwee-Domainarchitektur (Fig. S8b) mat ähnlechen 4HB an Ig-ähnlechen β-Sandwich-Domänen verbonne mat enger Scharnéierregioun (Fig. S8c).
IZUMO1 an SPACA6 4HB hunn gemeinsam Differenzen aus konventionelle Spiralbündel.Typesch 4HBs, wéi déi an SNARE Protein Komplexe fonnt, involvéiert an endosomal Fusioun 45,46, hunn gläichméisseg verdeelt Helices déi eng konstant Krümmung ronderëm eng Zentralachs erhalen 47. Am Géigesaz, goufen d'Helikaler Domainen a béid IZUMO1 an SPACA6 verzerrt, mat variabelen Krümmung an ongläich Verpakung (Figur S8d).D'Twist, wahrscheinlech verursaacht duerch den Dräieck geformt duerch d'Heliken 1', 1 an 2, gëtt am IZUMO1 an SPACA6 behalen a stabiliséiert duerch datselwecht CXXC Motiv op der Helix 1'.Wéi och ëmmer, déi zousätzlech Disulfidbindung, déi am SPACA6 fonnt gëtt (Cys41 a Cys55 kovalent déi Helices 1 an 2 uewe verbannen) schaaft e méi schaarfe Spëtz um Dräieckspëtz, wat SPACA6 méi verdreift mécht wéi IZUMO1, mat méi ausgeprägte Kavitéitsdräieck.Zousätzlech feelt IZUMO1 Arg37 observéiert am Zentrum vun dëser Huelraim am SPACA6.Am Géigesaz, huet IZUMO1 e méi typesche hydrophobesche Kär vun alifateschen an aromatesche Reschter.
IZUMO1 huet en Ig-ähnlechen Domain besteet aus engem duebelstrengegen a fënnefstrengegen β-Sheet43.Den extra Strang am IZUMO1 ersetzt d'Spule am SPACA6, deen mat der F Strang interagéiert fir d'Réckgratwasserstoffbindungen am Strang ze limitéieren.En interessante Punkt vum Verglach ass déi virausgesot Uewerflächladung vun den Ig-ähnlechen Domainen vun den zwee Proteinen.D'IZUMO1 Uewerfläch ass méi negativ gelueden wéi d'SPACA6 Uewerfläch.Eng zousätzlech Ladung ass no beim C-Terminus vis-à-vis vun der Spermienmembran.An SPACA6, waren déi selwecht Regiounen méi neutral oder positiv gelueden (Lalumi S8e).Zum Beispill sinn d'hydrophobe Uewerfläch (méi dënn Kanten) a positiv gelueden Pits (méi breet Kanten) am SPACA6 negativ gelueden an IZUMO1.
Obwuel d'Relatioun an de Secondaire Struktur Elementer tëscht IZUMO1 an SPACA6 gutt preservéiert sinn, huet d'strukturell Ausriichtung vun der Ig-wëll Beräicher gewisen, datt déi zwee Beräicher an hir allgemeng Orientatioun relativ zu all aner ënnerscheeden (Lalumi S9).D'Spiralbündel vum IZUMO1 ass ëm den β-Sandwich gekrümmt, an erstellt déi virdru beschriwwen "Boomerang" Form op ongeféier 50 ° vun der Zentralachs.Am Géigesaz war de spiralesche Strahl am SPACA6 ongeféier 10° an déi entgéintgesate Richtung gekippt.D'Ënnerscheeder an dësen Orientatiounen si méiglecherweis wéinst Differenzen an der Scharnéierregioun.Um primäre Sequenzniveau deelen IZUMO1 a SPACA6 wéineg Sequenz Ähnlechkeet um Scharnier, mat Ausnam vu Cystein, Glycin an Asparaginsäurereschter.Als Resultat si Waasserstoffbindungen an elektrostatesch Netzwierker komplett anescht.β-Blat sekundär Strukturelementer ginn duerch IZUMO1 a SPACA6 gedeelt, obwuel d'Ketten an IZUMO1 vill méi laang sinn an den 310 Helix (Helikus 5) ass eenzegaarteg fir SPACA6.Dës Differenzen resultéieren zu verschiddenen Domain Orientatiounen fir zwee soss ähnlech Proteinen.
Eis Dali Server Sich huet opgedeckt datt SPACA6 an IZUMO1 déi eenzeg zwee experimentell bestëmmte Strukturen sinn, déi an der Protein Datebank gespäichert sinn, déi dës speziell 4HB Fold hunn (Table S1).Méi viru kuerzem huet DeepMind (Alphabet / Google) AlphaFold entwéckelt, en neurale Netzwierk baséiert System deen d'3D Strukture vu Proteinen aus primäre Sequenzen präzis viraussoe kann48.Kuerz nodeems mir d'SPACA6 Struktur geléist hunn, gouf d'AlphaFold Datebank verëffentlecht, déi prévisiv Strukturmodeller ubidden, déi 98.5% vun alle Proteinen am mënschleche Proteome48,49 decken.Mat eiser geléist SPACA6 Struktur als Sichmodell, eng strukturell Homologie Sich fir de Modell am AlphaFold mënschleche Proteome identifizéiert Kandidaten mat méigleche strukturellen Ähnlechkeeten zu SPACA6 an IZUMO1.Mat der onheemlecher Genauegkeet vun AlphaFold bei der Viraussoen vun SPACA6 (Fig. S10a) - besonnesch den 1,1 Å rms Ectodomein am Verglach mat eiser geléister Struktur (Fig. S10b) - kënne mir zouversiichtlech sinn datt déi identifizéiert SPACA6 Matcher wahrscheinlech richteg sinn.
Virdrun huet PSI-BLAST no dem IZUMO1 Stärekoup mat dräi anere Spermien-assoziéierte Proteine ​​gesicht: IZUMO2, IZUMO3, an IZUMO450.AlphaFold virausgesot datt dës IZUMO Famill Proteine ​​sech an d'4HB Domain mat deemselwechten Disulfidbindungsmuster wéi IZUMO1 (Dorënner 3a a S11) falen, obwuel se en Ig-ähnlechen Domain feelen.Et gëtt hypothetiséiert datt IZUMO2 an IZUMO3 engsäiteg Membranproteine ​​sinn ähnlech wéi IZUMO1, während IZUMO4 schéngt sekretéiert ze ginn.D'Funktioune vun IZUMO 2, 3 a 4 Proteinen an der Gametefusioun sinn net festgestallt ginn.IZUMO3 ass bekannt fir eng Roll an der Akrosombiogenese wärend der Spermatozoa Entwécklung51 ze spillen, an den IZUMO Protein bildt e Komplex50.D'Konservatioun vun IZUMO Proteinen bei Mamendéieren, Reptilien an Amphibien hindeit datt hir potenziell Funktioun konsequent ass mat där vun anere bekannte Gamete-Fusioun-assoziéierte Proteinen, wéi DCST1/2, SOF1, a FIMP.
Diagramm vun der Domainarchitektur vun der IST Superfamily, mat 4HB, Scharnier, an Ig-ähnlechen Domainen, respektiv an orange, gréng a blo markéiert.IZUMO4 huet eng eenzegaarteg C-terminal Regioun déi schwaarz ausgesäit.Bestätegt a putativ Disulfidbindunge ginn duerch zolidd a punktéiert Linnen ugewisen, respektiv.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F15), (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) ginn an der selwechter Faarfpalette wéi Panel A ugewisen. Disulfidbindunge ginn a Magenta gewisen.TMEM95, IZUMO2 an IZUMO3 transmembrane Helices ginn net gewisen.
Am Géigesaz zum IZUMO Protein, aner SPACA Proteinen (dh SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, an SPACA9) gi geduecht strukturell anescht wéi SPACA6 (Fig. S12).Nëmmen SPACA9 huet 4HB, awer et gëtt net erwaart déiselwecht parallel-anti-parallell Orientéierung oder déiselwecht Disulfidbindung wéi SPACA6 ze hunn.Nëmmen SPACA1 huet en ähnlechen Ig-ähnlechen Domain.AlphaFold virausgesot datt SPACA3, SPACA4 an SPACA5 eng komplett aner Struktur hunn wéi SPACA6.Interessanterweis ass SPACA4 och bekannt fir eng Roll bei der Befruchtung ze spillen, awer zu engem méi groussen Ausmooss wéi SPACA6, amplaz d'Interaktioun tëscht Spermien an Oocyte zona pellucida52 erliichtert.
Eis AlphaFold Sich huet en anere Match fir IZUMO1 a SPACA6 4HB, TMEM95 fonnt.TMEM95, en eenzegt Spermienspezifesch Transmembranprotein, mécht männlech Mais onfruchtbar wann se ofgeschaaft ginn 32,33.Spermatozoa, déi TMEM95 feelen, haten normal Morphologie, Motilitéit an d'Fäegkeet fir d'Zona pellucida z'erreechen an un d'Ee Membran ze binden, awer konnt net mat der Oocyte Membran fusionéieren.Virdrun Studien hu gewisen datt TMEM95 strukturell Ähnlechkeeten mat IZUMO133 deelt.Tatsächlech bestätegt d'AlphaFold Modell datt TMEM95 e 4HB ass mat deemselwechte Pair vu CXXC Motiver wéi IZUMO1 an SPACA6 an déiselwecht zousätzlech Disulfidbindung tëscht Helices 1 an 2 fonnt an SPACA6 (Fig. 3a an S11).Obwuel TMEM95 en Ig-ähnlechen Domain feelt, huet et eng Regioun mat engem Disulfidbindungsmuster ähnlech wéi d'SPACA6 an IZUMO1 Scharnéierregiounen (Fig. 3b).Zu der Zäit vun der Verëffentlechung vun dësem Manuskript huet de Preprint-Server d'Struktur vum TMEM95 gemellt, wat d'Resultat vun AlphaFold53 bestätegt.TMEM95 ass ganz ähnlech zu SPACA6 an IZUMO1 an ass evolutiv schonn an Amphibien konservéiert (Figebam. 4 an S13).
D'PSI-BLAST Sich huet d'NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP a SOF1 Datenbanken benotzt fir d'Positioun vun dëse Sequenzen am Bam vum Liewen ze bestëmmen.Distanzen tëscht Filialpunkte ginn net op Skala gewisen.
Déi opfälleg allgemeng strukturell Ähnlechkeet tëscht SPACA6 an IZUMO1 hindeit datt si Grënnungsmembere vun enger konservéierter struktureller Superfamilie sinn, déi den TMEM95 an IZUMO 2, 3 a 4 Proteinen enthält.bekannt Memberen: IZUMO1, SPACA6 an TMEM95.Well nëmmen e puer Memberen Ig-ähnlech Domainen hunn, ass d'Markenzeeche vun der IST Superfamily d'4HB Domain, déi eenzegaarteg Feature fir all dës Proteinen huet: 1) Gerullt 4HB mat Helices arrangéiert an enger anti-parallel/parallel Alternatioun (Fig. 5a), 2) de Bündel huet en dräieckege Gesiicht, deen aus zwee Helices am Bündel an enger drëtter vertikaler Helix besteet (Fig. Schlësselberäich (Fig. 5c). D'CXXC Motiv, an thioredoxin-ähnleche Proteinen fonnt, ass bekannt fir ze funktionéieren als Redox Sensor 54,55,56, während d'Motiv an IST Familljemembere mat Protein disulfide isomerases wéi ERp57 an gamete Fusioun verbonne ginn.Roll sinn assoziéiert 57,58.
Membere vun der IST superfamily sinn definéiert vun dräi charakteristesche Fonctiounen vun der 4HB Domän: véier helices alternéieren tëscht parallel an antiparallel Orientatioun, ba-dreieckeg helical Bündel Gesiichter, an engem ca CXXC duebel Motiv tëscht klenge Molekülle geformt.) N-terminal Helixen (orange) a Scharnéierregioun β-Hoerpin (gréng).
Wéinst der Ähnlechkeet tëscht SPACA6 an IZUMO1, gouf d'Fäegkeet vun der fréierer getest fir un IZUMO1 oder JUNO ze binden.Biolayer Interferometrie (BLI) ass eng kinetesch-baséiert Bindungsmethod déi virdru benotzt gouf fir d'Interaktioun tëscht IZUMO1 a JUNO ze quantifizéieren.No der Inkubatioun vum Biotin-Label-Sensor mat IZUMO1 als Köder mat enger héijer Konzentratioun vu JUNO-Analyt, gouf e staarkt Signal festgestallt (Figebam. S14a), wat op eng bindend-entschlof Ännerung an der Dicke vum Biomaterial un de Sensortipp verbonnen ass.Ähnlech Signaler (dh JUNO gekoppelt un de Sensor als Köder géint IZUMO1 Analyt) (Figebam. S14b).Kee Signal gouf festgestallt wann SPACA6 als Analyt géint Sensor-gebonnen IZUMO1 oder Sensor-gebonnen JUNO benotzt gouf (Dorënner S14a, b).D'Feele vun dësem Signal weist datt den extrazelluläre Domain vu SPACA6 net mat der extrazellulärer Domain vun IZUMO1 oder JUNO interagéiert.
Well de BLI Assay baséiert op Biotinylatioun vu fräie Lysinreschter op dem Köderprotein, kann dës Modifikatioun Bindung verhënneren, wann Lysinreschter an der Interaktioun involvéiert sinn.Zousätzlech kann d'Orientéierung vun der Bindung relativ zum Sensor steresch Hindernisser kreéieren, sou datt konventionell Pull-Down Assays och op de rekombinante SPACA6, IZUMO1 a JUNO Ectodomains gemaach goufen.Trotz dëser, huet SPACA6 net Nidderschlag mat His-tagged IZUMO1 oder His-tagged JUNO (Lalumi. S14c, d), besot keng Interaktioun konsequent mat deem zu BLI Experimenter observéiert.Als positiv Kontroll bestätegt mir d'Interaktioun vun JUNO mat markéiert Seng IZUMO1 (Dorënner S14e an S15).
Trotz der struktureller Ähnlechkeet tëscht SPACA6 an IZUMO1, ass d'Onméiglechkeet vum SPACA6 fir JUNO ze binden net iwwerraschend.D'Uewerfläch vum mënschleche IZUMO1 huet méi wéi 20 Reschter déi mat JUNO interagéieren, dorënner Reschter aus jiddereng vun den dräi Regiounen (obwuel déi meescht vun hinnen am Scharnéierregioun sinn) (Lalumi S14f).Vun dëse Reschter ass nëmmen een am SPACA6 (Glu70) konservéiert.Wärend vill Reschtersubstitutiounen hir originell biochemesch Eegeschafte behalen hunn, gouf de essentielle Arg160 Rescht am IZUMO1 duerch den negativ geluedenen Asp148 am SPACA6 ersat;virdrun Studien hu gewisen datt d'Arg160Glu Mutatioun am IZUMO1 bal komplett d'Bindung op JUNO43 ofschaaft.Zousätzlech huet den Ënnerscheed an der Domainorientéierung tëscht IZUMO1 an SPACA6 d'Uewerfläch vum JUNO-bindende Site vun der gläichwäerteger Regioun op SPACA6 wesentlech erhéicht (Fig. S14g).
Trotz dem bekannte Besoin fir SPACA6 fir Gamete Fusioun a seng Ähnlechkeet zu IZUMO1, schéngt SPACA6 net eng gläichwäerteg JUNO bindend Funktioun ze hunn.Dofir hu mir versicht eis strukturell Donnéeën ze kombinéieren mat Beweiser vu Wichtegkeet vun der evolutiver Biologie.D'Sequenzausrichtung vu SPACA6 Homologen weist d'Konservatioun vun der gemeinsamer Struktur iwwer Mamendéieren.Zum Beispill, Cysteinreschter sinn och a wäit verwandte Amphibien präsent (Fig. 6a).Mat Hëllef vum ConSurf Server goufen Multiple Sequenzausrichtung Retentiondaten vu 66 Sequenzen op d'SPACA6 Uewerfläch kartéiert.Dës Zort vun Analyse kann weisen wéi eng Reschter wärend der Proteinevolutioun konservéiert goufen a kann uginn wéi eng Uewerflächregiounen eng Roll bei der Funktioun spillen.
eng Sequenz Ausrichtung vun SPACA6 Ectodomainen aus 12 verschidden Arten virbereet mat CLUSTAL OMEGA.Laut der ConSurf Analyse sinn déi konservativst Positioune blo markéiert.Cysteinreschter ginn a rout markéiert.Domain Grenzen a sekundär Strukturelementer ginn uewen op der Ausriichtung ugewisen, wou Pfeile β-Stränn weisen a Wellen Helices weisen.D'NCBI Access Identifiers, déi d'Sequenzen enthalen, sinn: Mënsch (Homo sapiens, NP_001303901), Mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), Capuchin Affe (Cebus mimic, XP_017359366), Päerd (Equus caballus, XP6_02ca, XP6_023, Killer, XP61023, XP6_023), Killer, XP61023 032_034).), Schof (Ovis Widder, XP_014955560), Elefant (Loxodonta africana, XP_010585293), Hond (Canis lupus familyis, XP_025277208), Maus (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanianer Däiwel, XPi31, XP31, XP31, Tasmanian devil, XP31 ), Platypus, 8) , 61_89 a Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).D'Nummeréierung baséiert op mënschlech Uerdnung.b Surface Representatioun vun der SPACA6 Struktur mat 4HB uewen an Ig-ähnlechen Domain um ënnen, Faarwen baséiert op Conservatioun Schätzunge vum ConSurf Server.Déi bescht bewahrt Deeler sinn a blo, déi mëttelméisseg bewahrt Deeler sinn a wäiss, an déi mannst bewahrt sinn a giel.purpurroude Cystein.Dräi Uewerflächeflecken, déi en héije Schutzniveau weisen, ginn an den Inset-markéierte Flecken 1, 2 an 3. A 4HB Cartoon gëtt am Inset uewe riets gewisen (selwescht Faarfschema).
D'SPACA6 Struktur huet dräi héich conserved Uewerfläch Regiounen (Fig. 6b).Patch 1 spant 4HB an d'Scharnierregioun an enthält zwee konservéiert CXXC Disulfidbrécke, en Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 Scharnéiernetz (Figebam. S7), an dräi konservéiert baussenzeg aromatesch Reschter (Phe31, Tyr73, Phe137)).e méi breede Rand vum Ig-ähnlechen Domain (Fig. S6e), wat e puer positiv gelueden Reschter op der Spermienfläch duerstellt.Interessanterweis enthält dëse Patch en Antikörperepitop, dee virdru gewise gouf fir mat der SPACA6 30 Funktioun ze stéieren.Regioun 3 spant d'Scharnier an eng Säit vum Ig-ähnlechen Domain;dës Regioun enthält konservéiert Prolinen (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) an no baussen geriicht polare / gelueden Reschter.Iwwerraschend, sinn déi meescht vun de Reschter op der Uewerfläch vun 4HB héich variabel (Figebam. 6b), obwuel de klappt conservat ganze SPACA6 homologue ass (wéi vun der conservatism vun der hydrophobic Bündel Kär uginn) an doriwwer eraus der IST superfamily.
Och wann dëst déi klengst Regioun am SPACA6 ass mat de mannsten detektéierbaren sekundäre Strukturelementer, sinn vill Scharnéierregioun Iwwerreschter (dorënner Regioun 3) héich konservéiert ënner SPACA6 Homologen, wat kann uginn datt d'Orientéierung vum helical Bündel a β-Sandwich eng Roll spillt.als konservativen.Wéi och ëmmer, trotz extensiv Waasserstoffverbindung an elektrostatesche Netzwierker an der Scharnéierregioun vu SPACA6 an IZUMO1, kënnen Beweiser fir intrinsesch Flexibilitéit an der Ausrichtung vun de multiple erlaabt Strukture vun IZUMO137,43,44 gesi ginn.D'Ausrichtung vun den eenzelne Domainen iwwerlappt gutt, awer d'Orientéierung vun den Domänen relativ zueneen variéiert vun 50 ° bis 70 ° vun der Zentralachs (Fig. S16).Fir d'konformational Dynamik vun SPACA6 zu Léisung ze verstoen, goufen SAXS Experimenter gesuergt (Lalumi S17a, b).Ab initio Rekonstruktioun vun der SPACA6 ectodomain entsprécht engem Staang Kristallsglas produzéiert Struktur (Lalumi S18), obwuel de Kratky Komplott e puer Ofschloss vun Flexibilitéit gewisen (Lalumi S17b).Dës Konformatioun kontrastéiert mam IZUMO1, an deem den ongebonnenen Protein eng Boomerang Form souwuel am Gitter an an der Léisung43 iwwerhëlt.
Fir spezifesch d'flexibel Regioun z'identifizéieren, Wasserstoff-Deuterium Austausch Mass Spectroscopy (H-DXMS) war op SPACA6 gesuergt a Verglach mat Donnéeën virdrun op IZUMO143 kritt (Lalumi 7a, b).SPACA6 ass kloer méi flexibel wéi IZUMO1, wéi duerch e méi héije Deuteriumaustausch uechter d'Struktur no 100.000 s Austausch uginn.A béide Strukturen weist den C-terminalen Deel vun der Scharnéierregioun en héijen Austauschniveau, wat méiglecherweis limitéiert Rotatioun vu 4HB an Ig-ähnlechen Domainen relativ zueneen erlaabt.Interessanterweis ass den C-terminalen Deel vum SPACA6 Scharnier, deen aus dem 147CDLPLDCP154 Rescht besteet, eng héich konservéiert Regioun 3 (Fig. 6b), wat eventuell beweist datt d'Interdomain Flexibilitéit eng evolutiv konservéiert Feature vu SPACA6 ass.No der Flexibilitéit Analyse, CD thermesch Schmelze Daten weisen datt SPACA6 (Tm = 51,2 ° C) manner stabil ass wéi IZUMO1 (Tm = 62,9 ° C) (Fig. S1e an S19).
engem H-DXMS Biller vun SPACA6 an b IZUMO1.De Prozentsaz Deuteriumaustausch gouf op den uginnen Zäitpunkte bestëmmt.Niveaue vum Waasserstoff-Deuteriumaustausch ginn duerch Faarf op enger Gradient Skala vu blo (10%) bis rout (90%) ugewisen.Schwaarz Këschte representéieren Beräicher vun héich Austausch.D'Grenze vu 4HB, Scharnier an Ig-ähnlechen Domain observéiert an der Kristallstruktur sinn iwwer der primärer Sequenz gewisen.Deuteriumaustauschniveauen op 10 s, 1000 s, an 100.000 s goufen op engem Sträifdiagramm geplot op déi transparent molekulare Flächen vu SPACA6 an IZUMO1 iwwerlagert.Deeler vu Strukturen mat engem Deuteriumaustauschniveau ënner 50% si wäiss faarweg.Beräicher iwwer 50% H-DXMS Austausch sinn an engem Gradient Skala faarweg.
D'Benotzung vu CRISPR / Cas9 a Maus Gen Knockout genetesch Strategien huet zu der Identifikatioun vu verschiddene Faktoren gefouert, déi wichteg sinn fir Spermien an Ee Bindung a Fusioun.Ausser der gutt charakteriséiert Interaktioun vun IZUMO1-JUNO an CD9 Struktur, déi meescht vun de Proteinen verbonne mat Gamete Fusioun bleiwen strukturell a funktionell enigmatesch.D'biophysikalesch a strukturell Charakteriséierung vu SPACA6 ass en anert Stéck vun der Adhäsioun / Fusioun molekulare Puzzel wärend der Befruchtung.
SPACA6 an aner Membere vun der IST superfamily schéngen héich conserved an Mamendéieren souwéi eenzel Villercher, Reptilien, an Amphibien ze ginn;Tatsächlech ass et geduecht datt SPACA6 souguer fir Befruchtung an Zebrafësch erfuerderlech ass 59. Dës Verdeelung ass ähnlech wéi aner bekannte Gamete Fusioun-assoziéiert Proteine ​​​​wéi DCST134, DCST234, FIMP31, an SOF132, wat suggeréiert datt dës Faktoren HAP2-defizit sinn (och bekannt als GCS1) Proteinen déi verantwortlech sinn fir d'katalytesch Aktivitéit vu ville Protisten., Planzen an Arthropoden.Befruchtet Fusiounsproteine ​​​​60, 61. Trotz der staarker struktureller Ähnlechkeet tëscht SPACA6 an IZUMO1, Knockout vun Genen, déi entweder vun dëse Proteine ​​​​kodéieren, huet zu Onfruchtbarkeet bei männleche Mais gefouert, wat beweist datt hir Funktiounen an der Gametefusioun net duplizéiert sinn..Méi breet ass kee vun de bekannte Spermienproteine ​​​​déi fir d'Adhäsiounsphase vun der Fusioun erfuerderlech sinn iwwerflësseg.
Et bleift eng oppe Fro ob SPACA6 (an aner Membere vun der IST Superfamily) un intergametesche Kräizunge matmaachen, intragametesch Netzwierker bilden fir wichteg Proteinen op Fusiounspunkten ze rekrutéieren, oder vläicht souguer als elusive Fusogenen handelen.Co-Immunoprecipitatiounsstudien an HEK293T Zellen hunn eng Interaktioun tëscht voller Längt IZUMO1 a SPACA632 opgedeckt.Wéi och ëmmer, eis rekombinant Ectodomaine interagéiert net in vitro, suggeréiert datt d'Interaktiounen an Noda et al gesinn.goufen souwuel am Konstrukt geläscht (Notiz de cytoplasmic Schwäif vun IZUMO1, déi fir fertilization62 onnéideg gewisen gouf).Alternativ kënnen IZUMO1 an / oder SPACA6 spezifesch bindend Ëmfeld erfuerderen, déi mir net in vitro reproduzéieren, sou wéi physiologesch spezifesch Konformatiounen oder molekulare Komplexe mat anere Proteinen (bekannt oder nach net entdeckt).Och wann den IZUMO1 Ectodomain ugeholl gëtt d'Befestegung vu Spermatozoa un d'Ee am Perivitelline Raum ze vermëttelen, ass den Zweck vum SPACA6 Ectodomain onkloer.
D'Struktur vu SPACA6 enthält verschidde konservéiert Flächen, déi an Protein-Protein Interaktiounen involvéiert kënne sinn.De konservéierten Deel vun der Scharnéierregioun direkt nieft dem CXXC Motiv (bezeechent Patch 1 hei uewen) huet e puer no bausse viséiert aromatesch Reschter déi dacks mat hydrophobesch an π-Stacking Interaktiounen tëscht Biomolekülen verbonne sinn.Déi breet Säiten vun der Ig-wëll Domän (Regioun 2) Form eng positiv gelueden Groove mat héich conserved Arg a Seng Reschter, an antibodies géint dës Regioun hu virdrun benotzt gamete Fusioun 30 ze blockéieren.Den Antikörper erkennt de linearem Epitop 212RIRPAQLTHRGTFS225, deen dräi vun de sechs Argininreschter an héich konservéiert His220 huet.Et ass net kloer ob d'Dysfunktion wéinst Blockéierung vun dëse spezifesche Reschter oder der ganzer Regioun ass.D'Plaz vun dësem Spalt no bei der C-Terminus vum β-Sandwich weist op cis-Interaktioune mat Nopesch Spermienproteine, awer net mat Oocyteproteine.Ausserdeem kann d'Retentioun vun engem héich flexiblen prolinräiche Wénkel (Site 3) am Scharnier de Site vun enger Protein-Protein Interaktioun sinn oder, méi wahrscheinlech, d'Retentioun vu Flexibilitéit tëscht den zwee Domainen uginn.Geschlecht ass wichteg fir déi onbekannt Roll vu SPACA6.Fusioun vu Gameten.
SPACA6 huet Eegeschafte vun interzelluläre Adhäsiounsproteine, dorënner Ig-ähnlech β-Sandwichen.Vill Klebstoffproteine ​​​​(zB Cadherine, Integrine, Adhesinen an IZUMO1) besëtzen een oder méi β-Sandwich Domainen, déi Proteine ​​​​vun der Zellmembran op hir Ëmweltziler verlängeren63,64,65.Den Ig-ähnlechen Domain vu SPACA6 enthält och e Motiv, deen allgemeng a β-Sandwichen vun der Adhäsioun a Kohäsioun fonnt gëtt: Doublets vu parallele Strécke um Enn vun β-Sandwichen, bekannt als mechanesch Klameren66.Et gëtt ugeholl datt dëst Motiv d'Resistenz géint Schéierkraaft erhéicht, wat wäertvoll ass fir Proteinen déi an interzelluläre Interaktiounen involvéiert sinn.Wéi och ëmmer, trotz dëser Ähnlechkeet mat Adhesinen, gëtt et momentan keng Beweiser datt SPACA6 mat Eewäiss interagéiert.D'SPACA6 Ectodomain ass net fäeg un JUNO ze binden, an SPACA6-ausdréckend HEK293T Zellen, wéi hei gewisen, kaum interagéieren mat Oocyten déi Zona 32 feelen.Wann SPACA6 intergametesch Obligatiounen etabléiert, kënnen dës Interaktioune post-translational Modifikatioune oder Stabiliséierung vun anere Spermienproteine ​​​​erfuerderen.Fir d'Ënnerstëtzung vun der leschter Hypothese binden IZUMO1-defizit Spermatozoa un Oocyten, wat beweist datt aner Molekülen wéi IZUMO1 an der Gamete Adhäsiounsschrëtt 27 involvéiert sinn.
Vill viral, cellulär an Entwécklungsfusiounsproteine ​​hunn Eegeschaften déi hir Funktioun als Fusogene viraussoen.Zum Beispill, viral Fusiounsglycoproteine ​​(Klassen I, II an III) hunn en hydrophobe Fusiounspeptid oder Loop um Enn vum Protein deen an d'Hostmembran agebaut gëtt.D'Hydrophilizitéitskaart vun IZUMO143 an d'Struktur (bestëmmt a virausgesot) vun der IST Superfamily huet keng scheinbar hydrophobe Fusiounspeptid gewisen.Also, wann Proteinen an der IST Superfamily funktionnéieren als Fusogene, maache se dat op eng Manéier anescht wéi aner bekannte Beispiller.
Als Conclusioun bleiwen d'Funktioune vun de Membere vun der IST Superfamily vu Proteinen, déi mat Gamete Fusioun assoziéiert sinn, e verlockende Geheimnis.Eis charakteriséiert SPACA6 rekombinant Molekül a seng geléist Struktur gëtt Abléck an d'Relatiounen tëscht dëse gemeinsame Strukturen an hir Roll am Gamete Uschloss a Fusioun.
D'DNA Haaptrei entspriechend dem virausgesot mënschlech SPACA6 ectodomain (NCBI Bäitrëtt Zuel NP_001303901.1; Reschter 27-246) war codon-optimiséiert fir Ausdrock an Drosophila melanogaster S2 Zellen an als Gentherapie Fragment mat der Haaptrei Kozak Kozak (Eurofins Genomics) synthetiséiert., de BiP secretion Signal an déi entspriechend 5' an 3' Enn fir ligation-onofhängeg Klonen vun dësem Gen an engem pMT Ausdrock Vecteure baséiert op engem metallothionein Promoteur fir Selektioun mat puromycin (pMT-puro) modifizéiert.D'pMT-Puro Vecteure encodes engem Thrombin Spaltung Site gefollegt vun engem 10x-Säi C-Uschloss Tag (Dorënner S2).
Stabil transfection vun der SPACA6 pMT-puro Vecteure an D. melanogaster S2 (Gibco) Zellen war ähnlech zu de Protokoll fir IZUMO1 an JUNO43 benotzt gesuergt.S2 Zellen goufen thawed an ugebaut an Schneider d'Medium (Gibco) ergänzt mat enger Finale Konzentratioun vun 10% (v/v) Hëtzt-inactivated Fetal Kallef Serum (Gibco) an 1X antimycotic Antibiotike (Gibco).Fréi Passage Zellen (3,0 x 106 Zellen) sech an eenzelne Wells vun 6-gutt Placke plated (Corning).No 24 Stonnen vun incubation bei 27 ° C, Zellen sech mat enger Mëschung aus 2 MG vun der SPACA6 pMT-puro Vecteure an Effectene transfection reagent transfected (Qiagen) no dem Fabrikant d'Protokoll.Transfected Zellen sech fir 72 Stonnen incubated an dann mat 6 mg /ml puromycin recoltéiert.Zellen goufen dunn aus komplette Schneider's Medium isoléiert an an serumfräi Insekt-XPRESS Medium (Lonza) plazéiert fir grouss Skala Proteinproduktioun.A 1 L Konte gefouert vun S2 Zell Kultur war zu 8-10 × 106 ml-1 Zellen an engem 2 L gelëfter flaach-bottom polypropylene Erlenmeyer flask ugebaut an dann mat enger Finale Konzentratioun vun 500 μM CuSO4 (Millipore Sigma) steriliséiert an steril gefiltert.induzéiert.Déi induzéiert Kulturen goufen op 27 ° C. bei 120 RPM fir véier Deeg inkubéiert.
Conditionéiert Medium mat SPACA6 gouf isoléiert duerch Zentrifugatioun bei 5660 × g bei 4 ° C gefollegt vun engem Centramate tangential Flow Filtratiounssystem (Pall Corp) mat enger 10 kDa MWCO Membran.Fëllt konzentréiert Medium mat SPACA6 op eng 2 ml Ni-NTA Agaroseharz (Qiagen) Kolonn.D'Ni-NTA resin war mat 10 Kolonn Bänn (CV) vun Prellbock A gewäsch an dann 1 CV vun Prellbock A dobäi eng final imidazole Konzentratioun vun 50 mM ginn.SPACA6 war mat 10 ml vun Prellbock A ergänzt mat imidazole zu enger Finale Konzentratioun vun 500 mm elued.Restriktioun Klass Thrombin (Millipore Sigma) war direkt un der dialysis tubing (MWCO 12-14 kDa) op 1 Eenheet pro MG SPACA6 vs 1 L 10 mm Tris-HCl, pH 7,5 an 150 mm NaCl (Puffer B) fir Dialyse dobäi.) bei 4°C fir 48 Stonnen.Den Thrombin-gespalten SPACA6 gouf dann dräifach verdünnt fir d'Salzkonzentratioun ze reduzéieren an op eng 1 ml MonoS 5/50 GL Kationaustauschkolonn (Cytiva / GE) equilibréiert mat 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 gelueden.D'cation exchanger war mat 3 OK 10 mm Tris-HCl, pH 7,5 gewäsch, dann SPACA6 war mat engem linear Gradient vun 0 bis 500 mm NaCl an 10 mm Tris-HCl, pH 7,5 fir 25 OK elued.No Ionenaustauschchromatographie gouf SPACA6 op 1 ml konzentréiert an isokratesch aus enger ENrich SEC650 10 x 300 Kolonn (BioRad) equilibréiert mat Puffer B. Laut dem Chromatogramm, Pool a Konzentratfraktiounen mat SPACA6.Rengheet gouf kontrolléiert duerch Coomassie-gefierft Elektrophorese op engem 16% SDS-Polyacrylamidgel.Protein Konzentratioun gouf quantifizéiert duerch Absorptioun bei 280 nm mam Beer-Lambert Gesetz an dem theoreteschen molaren Ausstierwenskoeffizient.
Purifizéiert SPACA6 gouf iwwer Nuecht géint 10 mm Natriumphosphat, pH 7,4 an 150 mm NaF dialyséiert a verdünnt op 0,16 mg /ml virun der Analyse duerch CD Spektroskopie.Spektral Scannen vun CDen mat enger Wellelängt vun 185 bis 260 nm gouf op engem Jasco J-1500 Spektropolarimeter gesammelt mat Quarzkuvette mat enger 1 mm optescher Weelängt (Helma) bei 25 ° C mat enger Rate vu 50 nm / min.D'CD Spektre goufen Baseline korrigéiert, duerchschnëttlech iwwer 10 Acquisitioune gemooss, an ëmgewandelt an mëttlere Reschtelliptikitéit (θMRE) a Grad cm2 /dmol:
wou MW d'molekulare Gewiicht vun all Prouf am Da ass;N ass d'Zuel vun Aminosäuren;θ ass d'Elliptikitéit a Milligrad;d entsprécht der Längt vum optesche Wee a cm;Protein Konzentratioun an Eenheeten.