347 12.7*1.24mm Edelstahl opgerullt Réier, Molekulare Mechanismus vun der synchroner elektrostatescher Kondensatioun a Koaggregatioun vun α-Synuclein an Tau

Merci fir besicht Nature.com.Dir benotzt eng Browser Versioun mat limitéierter CSS Ënnerstëtzung.Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten).Zousätzlech, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, weisen mir de Site ouni Stiler a JavaScript.
Sliders déi dräi Artikelen pro Rutsch weisen.Benotzt d'Réck- an d'nächst Knäppercher fir duerch d'Rutschen ze réckelen, oder d'Slide Controller Knäppercher um Enn fir duerch all Rutsch ze réckelen.

347 STAINLESS Steel Pipe Spezifizéierung

347 12,7 * 1,24 mm Edelstahl opgerullt Réier

Baussenduerchmiesser: 6,00 mm OD bis 914,4 mm OD, Gréissten bis 24” NB verfügbar Ex-stock, OD Gréisst Stahlröhren verfügbar Ex-stock

SS 347 Pipe Thickness Range: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, etc. (0,5-12mm) Oder onregelméisseg Gréisst fir ugepasst ze ginn wéi néideg

Typ: SS 347 Nahtlos Pipes |SS 347 ERW Pipes |SS 347 geschweißte Pipes |SS 347 fabrizéiert Pipes |SS 347 CDW Tubes, LSAW Pipes / Seam-Wolded / Redrawn

Form: SS 347 Ronn Pipes / Tubes, SS 347 Square Pipes / Tubes, SS 347 Rechteck Pipe / Tubes, SS 347 Coiled Tubes, SS 347 "U" Form, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 Hydraulic Tubes

Längt: eenzeg zoufälleg, duebel zoufälleg & erfuerderlech Längt Enn: Einfach Enn, Beveled Enn, Treaded

Enn Schutz: Plastik Caps |Ausserhalb Finish: 2B, No.4, No.1, No.8 Spigelfinish fir Edelstahlleitungen, Finish wéi pro Client Ufuerderunge

Liwwerung Conditioun: Annealed a Pickled, poléiert, hell Annealed, Kalt gezunn

Inspektioun, Testberichter: Mill Test Certificates, EN 10204 3.1, Chemesch Berichter, Mechanesch Berichter, PMI Test Berichter, Visuell Inspektioun Berichter, Drëtt Partei Inspektioun Berichter, NABL Genehmegt Labo Berichter, Destruktiv Test Bericht, Net zerstéierend Test Berichter

Verpackung: Verpackt an Holzkëschten, Plastikstuten, Stahlstreifen gebündelt, oder wéi pro Client Ufro

Spezialfäegkeeten: Gréissten a Spezifikatioune aner wéi uewen kann op Ufro hiergestallt ginn

SS 347 Pipe Gréisst Range: 1/2 Zoll NB, OD bis 24 Zoll

ASTM A312 347: Nahtlos a riicht Naht geschweißt austenitescht Päif geduecht fir héich Temperaturen an allgemeng korrosiv Service.Filler Metal net erlaabt während Schweess.

ASTM A358 347: Elektresch Fusioun verschweißte austenitesche Päif fir korrosiv an / oder héich Temperaturdéngscht.Typesch nëmmen Päif bis 8 Zoll gëtt zu dëser Spezifizéierung produzéiert.D'Additioun vum Füllmetall ass erlaabt wärend der Schweißen.

ASTM A790 347: Nahtlos a riicht Naht verschweißte ferritesch / austenitesch (Duplex) Päif geduecht fir allgemeng korrosiv Service, mat engem besonnesche Schwéierpunkt op Resistenz géint Stresskorrosiounsrëss.

ASTM A409 347: Straight-seam oder spiral-seam elektresch Fusioun verschweißte austenitesche Liichtwandleitung mat groussen Duerchmiesser a Gréissten 14" bis 30" mat Maueren Sch5S a Sch 10S fir korrosiv an / oder héich

ASTM A376 347: Nahtlos austenitescht Päif fir Héichtemperaturapplikatiounen.

ASTM A813 347: Single-Seam, Single- oder Double-Schweess austenitescht Päif fir héich Temperaturen an allgemeng korrosiv Uwendungen.

ASTM A814 347: Kalt geschweißt austenitescht Päif fir héich Temperaturen an allgemeng korrosiv Service.

347H STAINLESS Steel Pipes Chemesch Zesummesetzung

STAINLESS Stol 347H Pipe mechanesch Eegeschafte

STAINLESS Stol 347H Päifen Kierperlech Eegeschafte

Äquivalent Grad fir 347H Edelstahl Pipe

Amyloid Alpha-Synuklein (αS) Aggregatioun ass en Zeechen vun der Parkinson Krankheet an aner Synukleinopathien.Viru kuerzem ass den Tau Protein, deen allgemeng mat der Alzheimer Krankheet assoziéiert ass, mat der αS Pathologie assoziéiert ginn a fonnt datt se an αS-räiche Inklusiounen co-lokaliséieren, obwuel de molekulare Mechanismus vun der Koaggregatioun vun deenen zwee Proteinen onkloer bleift.Mir berichten hei datt d'αS Phase sech a flëssege Kondensater iwwer elektrostatesch komplex Kondensatioun mat positiv gelueden Polypeptide wéi Tau trennt.Ofhängeg vun der Affinitéit vum αS fir Polykationen an dem Taux vun der Valenzverschmotzung vum Koagulatiounsnetz, ginn d'Knollen séier Geléierung oder Koaleszenz gefollegt vun der lueser Amyloid Aggregatioun.Duerch d'Kombinatioun vun enger Suite vu fortgeschratt biophysikaleschen Techniken, konnte mir d'flësseg-flësseg αS / Tau Phase Trennung charakteriséieren an d'Schlësselfaktoren identifizéieren, déi zu der Bildung vun heterogenen Aggregaten féieren, déi béid Proteinen an engem flëssege Proteinkondensat enthalen.
Zousätzlech zu Membrankompartimenter kann raimlech Trennung an Zellen och erreecht ginn duerch d'Bildung vu proteinreichen, flëssegähnlechen dichte Kierper, genannt biomolekulare Kondensater oder Drëpsen, duerch e Prozess bekannt als flësseg-flësseg Phase-Trennung (LLPS).Dës Drëpse ginn duerch multivalent temporär Interaktiounen geformt, normalerweis tëscht Proteinen oder Proteinen a RNA, an déngen eng Vielfalt vu Funktiounen a bal all Liewenssystemer.Eng grouss Zuel vu LLP-fähig Proteinen weisen Sequenzen vu gerénger Komplexitéit déi an der Natur héich gestéiert sinn an an der Bildung vu biomolekuläre Kondensater3,4,5.Vill experimentell Studien hunn déi flexibel, dacks gestéiert, a multivalent Natur vun de Proteinen opgedeckt, déi dës flëssegähnlech Kondensater ausmaachen, obwuel wéineg iwwer déi spezifesch molekulare Determinanten bekannt ass, déi de Wuesstum an d'Reifung vun dëse Kondensaten zu engem méi zolittähnlechen Kondensat kontrolléieren. Staat..
Déi nei Donnéeën ënnerstëtzen d'Hypothese datt aberrant Protein-gedriwwen LLPS an Transformatioun vun Drëpsen an zolidd Strukture relevant cellulär Weeër kënne sinn, déi zu der Bildung vun onlöslechen gëftege Aggregate féieren, déi dacks Markenzeeche vun degenerativen Krankheeten sinn.Vill LLPS-assoziéiert intrinsesch gestéiert Proteinen (IDPs), dacks héich gelueden a flexibel, si laang mat Neurodegeneratioun duerch de Prozess vun der Amyloid Aggregatioun assoziéiert.Besonnesch biomolekulär IDP Kondensater wéi FUS7 oder TDP-438 oder Proteine ​​mat grousser gerénger Komplexitéit Beräicher wéi hnRNPA19 hu gewisen datt se an gelähnlechen oder souguer zolidd Formen duerch e Prozess genannt Fluidiséierung alen.zesummegesat.zu Solid Phase Transitioun (LSPT) als Funktioun vun der Zäit oder als Äntwert op bestëmmte post-translational Modifikatiounen oder pathologesch bedeitend Mutatiounen1,7.
Eng aner IDP assoziéiert mat LLPS in vivo ass Tau, e Mikrotubule-assoziéiert gestéiert Protein deem seng Amyloid Aggregatioun an der Alzheimer Krankheet implizéiert gouf10 awer och viru kuerzem an der Parkinson Krankheet (PD) implizéiert gouf an aner synaptesch nuklear Proteinopathien 11, 12, 13 si verwandt.Tau ass gezeechent datt se spontan vun der Léisung / Cytoplasma dissoziéieren wéinst gënschtege elektrostatesche Interaktiounen14, wat zu der Bildung vun tau-beräicherten Drëpsen als elektrostatesch Koacervate bekannt ass.Et gouf och beobachtet datt dës Zort vun net-spezifescher Interaktioun d'Treibkraaft hannert ville biomolekuläre Kondensater an der Natur ass15.Am Fall vun engem Tau Protein kann elektrostatesch Aggregatioun duerch einfach Aggregatioun geformt ginn, an där entgéint gelueden Regioune vum Protein de Spaltprozess ausléisen, oder duerch komplex Aggregatioun duerch Interaktioun mat negativ gelueden Polymere wéi RNA.
Viru kuerzem ass α-Synuclein (αS), en Amyloid IDP implizéiert an PD an aner neurodegenerative Krankheeten, kollektiv bekannt als Synukleinopathie17,18, an Zellular- an Déieremodeller19,20 bewisen, konzentréiert a Proteinkondensate mat flëssege Verhalen.In vitro Studien hu gewisen datt αS LLPS duerch einfach Aggregatioun duerch haaptsächlech hydrophobesch Interaktiounen erfëllt, obwuel dëse Prozess aussergewéinlech héich Proteinkonzentratioune an atypesch laang Inkubatiounszäiten erfuerdert19,21.Ob déi αS-halteg Kondensater, déi in vivo observéiert ginn, duerch dësen oder aner LLPS Prozesser geformt ginn, bleift e Schlëssel ongeléist Thema.Ähnlech, obwuel αS Amyloid Aggregatioun an Neuronen an PD an aner Synukleinopathien beobachtet gouf, bleift de genaue Mechanismus, duerch deen αS intrazellulär Amyloid Aggregatioun erfëllt, onkloer, well d'Iwwerexpressioun vun dësem Protein schéngt dëse Prozess net selwer auszeléisen.Zousätzlech cellulär Schued ass dacks erfuerderlech, suggeréiert datt verschidde cellulär Plazen oder Mikroëmfeld fir d'Renucleatioun vun intrazellulären αS Amyloidversammlungen erfuerderlech sinn.Een cellulärt Ëmfeld dat besonnesch ufälleg ass fir Aggregatioun kann den Interieur vu Proteinkondensate 23 sinn.
Interessanterweis goufen αS an tau fonnt fir an charakteristesche Krankheetsinklusiounen bei Mënschen mat der Parkinson Krankheet an aner Synucleinopathien 24,25 ze co-lokaliséieren an Experimenter hunn eng synergistesch pathologesch Relatioun tëscht den zwee Proteinen gemellt 26,27, wat eng potenziell Relatioun tëscht Aggregatioun αS an αS suggeréiert. tau bei neurodegenerative Krankheeten.Krankheet.αS an Tau goufen fonnt fir d'Aggregatioun vuneneen ze interagéieren an ze förderen in vitro an in vivo 28,29 an heterogen Aggregaten, déi aus dësen zwee Proteinen komponéiert sinn, goufen am Gehir vu Patienten mat Synukleinopathien 30 observéiert.Wéi och ëmmer, wéineg ass bekannt iwwer d'molekulare Basis vun der Interaktioun tëscht αS an tau an de Mechanismus vu senger Co-Aggregatioun.αS gouf gemellt fir mat Tau duerch eng elektrostatesch Attraktioun tëscht der héich negativ gelueden C-terminal Regioun vun αS an der zentraler prolinräicher Regioun vun Tau ze interagéieren, déi och a positiv gelueden Reschter beräichert ass.
An dëser Etude weisen mir datt αS wierklech an Drëpsen iwwer elektrostatesch komplex Kondensatioun an der Präsenz vum Tau Protein dissoziéiere kann, am Géigesaz zu senger Interaktioun mat anere positiv gelueden Polypeptiden wéi Poly-L-Lysin (pLK), an an dësem Prozess.αS wierkt als Steemolekül fir den Drëpsnetz.Mir hunn bemierkenswäert Differenzen am Prozess vun der Reifung vun elektrostateschen αS-Koacervaten identifizéiert, déi mat Differenzen an der Valenz an der Stäerkt vun der Interaktioun vu Proteinen am Koacervatnetz involvéiert sinn.Interessanterweis hu mir Co-Aggregatioun vun αS an Tau Amyloid Proteinen a laangliewege flëssege Koacervaten observéiert an e puer Schlësselfaktoren identifizéiert, déi zu Co-Aggregatioun vun dësen zwee Proteinen an esou Koacervate féieren.Hei beschreiwen mir am Detail dëse Prozess, deen e méigleche molekulare Mechanismus ass, deen d'Kolokaliséierung vun zwee Proteinen a Krankheetspezifesch Inklusiounen ënnerläit.
αS huet eng héich anionic C-terminal Schwäif um neutralen pH (Figebam. 1a), a mir hypothetiséiert, datt et LLPS duerch d'Kondensatioun vun elektrostatesche Komplexe mat polycationic gestéiert polypeptide Molekülle ënnergoe kéint.Mir hunn e 100-Rescht Poly-L-Lysin (pLK) als Startmodellmolekül benotzt wéinst senger positiv gelueden an gestéierter polymerescher Natur bei neutralen pH 32. Als éischt hu mir bestätegt datt pLK mat der Ct-Domän vun αS iwwer Léisung NMR-Spektroskopie interagéiert. (Dorënner 1b) benotzt 13C /15N-Label αS an der Präsenz vun Erhéijung αS: pLK molar Verhältnisser.D'Interaktioun vu pLK mat dem Ct-Domän vun αS manifestéiert sech a Stéierunge vun der chemescher Verréckelung an enger Ofsenkung vun der Peakintensitéit an dëser Regioun vum Protein.Interessanterweis, wa mir αS mat pLK bei enger αS Konzentratioun vun ca.5-25 µM an der Präsenz vu Polyethylenglycol (5-15% PEG-8) (typesch LLPS-Puffer: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) si mir direkt duerch e breet Feld vun der Proteinbildung gaang .Tropfen goufen mat Fluoreszenz (WF) an Hellfeld (BF) Mikroskopie (Fig. 1c) observéiert.1-5 µm Drëpsen, déi konzentréiert αS enthalen (1 µM AlexaFluor488-markéiert αS, AF488-αS), hir elektrostatesch Eegeschafte kënnen ofgeleet ginn aus hirer Resistenz géint 10% 1,6-Hexandiol (1,6-HD) a seng Empfindlechkeet fir eng Erhéijung vun der NaCl Konzentratioun (Fig. 1c).Déi flëssegähnlech Natur vun de Koacervate vum αS / pLK elektrostatesche Komplex gëtt bewisen duerch hir Fäegkeet fir bannent Millisekonnen ze fusionéieren (Fig. 1d).Mat Turbidimetrie quantifizéiert mir d'Bildung vun Drëpsen ënner dëse Konditiounen, bestätegt d'elektrostatesch Natur vun der Haaptinteraktioun, déi mat senger Stabilitéit assoziéiert ass (Fig. 1e), an evaluéiert den Effekt vu verschiddene Polymerverhältnisser op den LLPS-Prozess (Fig. 1f).Och wann d'Drëpsbildung iwwer eng breet Palette vu Polymerverhältnisser beobachtet gëtt, ass de Prozess ganz gënschteg wann pLK méi wéi αS ass.LLPs goufen och beobachtet mat dem chemeschen ënnerschiddlechen Verdrängungsmëttel Dextran-70 (70 kDa) oder mat enger Vielfalt vu Probeformater, dorënner Glasrutschdrëpsen, Mikroplate Wells vu verschiddene Materialien, Eppendorf oder Quarz Kapillaren.
eng schematesch Representatioun vu verschiddene Proteinregiounen an de WT-αS an ΔCt-αS Varianten, déi an dëser Studie benotzt goufen.Déi amphipathesch N-terminal Domain, déi hydrophobe Amyloid-forméierend (NAC) Regioun, an déi negativ gelueden C-terminal Domain ginn respektiv a blo, orange a rout gewisen.D'Net Charge Per Residual (NCPR) Kaart vun WT-αS gëtt gewisen.b NMR Analyse vun der αS / pLK Interaktioun an der Verontreiung vu makromolekuläre Klumpen.Wéi d'PLK Konzentratioun eropgeet (αS: pLK molar Verhältnisser vun 1:0,5, 1:1,5 an 1:10 ginn an hellgréng, gréng an donkelgréng ugewisen, respektiv).c Coacervate αS/pLK (molar Verhältnis 1:10) bei 25 µM (1 µM AF488-label αS oder Atto647N-labeled pLK fir WF Imaging) am LLPS Puffer (uewen) oder ergänzt mat 500 mM NaCl (ënnescht lénks) oder no 10 % 1,6-Hexandiol (1,6-HD; riets ënnen).Skala Bar = 20 µm.d Vertrieder mikroskopesch Biller vun BF Tropfen Fusioun vun αS /pLK (molar Verhältnis 1:10) bei enger Konzentratioun vun 25 μM;Pfeile weisen op d'Fusioun vun eenzelne Drëpsen (rout a giel Pfeiler) an en neien Drëps (orange Pfeil) bannent 200 ms).Skala Bar = 20 µm.e Liichtverstreuung (bei 350 nm) αS / pLK Aggregatioun am LLPS Puffer virun an no Zousatz vun 500 mM NaCl oder 10% 1,6-HD bei 25 µM αS (N = 3 Probe Replikat, mëttler a Standarddeviatioun och uginn).f BF Bild (uewen) a Liichtstreuen Analyse (op 350 nm, ënnen) vun αS /pLK Aggregatioun op 25 μM αS mat Erhéijung αS: pLK molar Verhältnis (N = 3 Prouf replizéiert, mëttlerer an Standard deviation och uginn).Skala Bar = 10 µm.D'Skalabar op engem Bild weist d'Skala vun alle Biller an engem Panel un.Raw Daten ginn a Form vu Matière Datendateien zur Verfügung gestallt.
Baséierend op eis Observatioune vun αS / pLK elektrostatesch Komplex Kondensatioun a fréier Observatioune vun αS als Client Molekül vum tau / RNA Kondensat duerch direkt Interaktioun mat tau31, hu mir hypothetiséiert datt αS an tau sech mam Léisungsmëttel an der Verontreiung vu RNA kéinten ausscheeden. Kondensatioun.duerch elektrostatesch Komplexe, an αS ass d'Schaffoldprotein an αS /Tau-Koacervaten (kuckt d'Tau-Ladeverdeelung an der Figur 2e).Mir observéiert datt wann 10 μM αS an 10 μM Tau441 (enthale 1 μM AF488-αS an 1 μM Atto647N-Tau, respektiv) an LLPS Puffer gemëscht goufen, hu se einfach Proteinaggregate geformt, déi béid Proteinen enthalen, wéi duerch WF Mikroskopie gesi ginn.(Fig. 2a).D'Kolokaliséierung vun den zwee Proteinen an den Drëpsen gouf duerch konfokal (CF) Mikroskopie (Ergänzlech Fig. 1a) bestätegt.Ähnlech Verhalen gouf observéiert wann dextran-70 als Aggregatiounsagent benotzt gouf (Ergänzlech Lalumi 1c).Mat entweder FITC-Label PEG oder Dextran, hu mir festgestallt, datt béid crowding Agenten gleichméisseg iwwer d'Proben verdeelt goufen, weder Segregatioun nach Associatioun ze weisen (Ergänzungs Fig. 1d).Éischter suggeréiert et datt se an dësem System d'Phase-Trennung duerch makromolekulare Crowd-Effekter förderen, well PEG e préférentiell stabile Crowd-Agent ass, wéi an anere LLP-Systemer gesi ginn33,34.Dës Protein-räiche Tropfen waren sensibel op NaCl (1 M) awer net op 1,6-HD (10% v / v), déi hir elektrostatesch Eegeschaften bestätegt (Ergänzlech Fig. 2a, b).Hir flësseg Verhalen gouf bestätegt duerch Observatioun vun Millisekonne fusionéiere Tropfenevenementer mat BF Mikroskopie (Fig. 2b).
eng Konfokal (CF) Mikroskopie Biller vun αS / Tau441 coacervates am LLPS Puffer (10 μM vun all Protein, 0,5 μM vun AF488-label αS an Atto647N-Label Tau441).b Representativ Differentialinterferenzkontrast (DIC) Biller vun αS /Tau441 Tropfenfusiounsevenementer (10 μM fir all Protein).c Phasediagramm baséiert op Liichtstreet (bei 350 nm) vun Tau441 LLPS (0-15 µM) an der Verontreiung (lénks) oder Präsenz (riets) vu 50 µM αS.Méi waarm Faarwen weisen op méi Streuung.d Liichtverstreeung vun αS / Tau441 LLPS Proben mat enger Erhéijung vun der αS Konzentratioun (Tau441 bei 5 µM, N = 2-3 Probe Wiederholungen wéi uginn).e Schematesch Representatioun vun e puer Tau Protein Varianten a verschiddene Regioune vum Protein, deen an dëser Etude benotzt gëtt: negativ gelueden N-terminal Domain (rout), prolinräich Regioun (blo), mikrotubule-bindend Domain (MTBD, an orange markéiert), an Amyloid-bildende Paarspiral.Filamentregiounen (PHF) bannent der MTBD (gro).D'Net Charge Per Residue (NCPR) Kaart vun Tau441 gëtt gewisen.f Benotzt 1 µM AF488-markéiert αS an Atto647N-label ΔNt-, benotzt 1 µM AF488-label αS oder ΔCt-αS an der Präsenz vun ΔNt-Tau (uewen, 10 µM pro Protein) oder K150 µM Protein, pro µM Protein ) ) ) Mikrographe vu WF kondenséiert an LLPS oder K18 Puffer.D'Skalabaren an engem Bild representéieren d'Skala vun alle Biller an engem Panel (20 µm fir Panelen a, b a f).Raw Daten fir Paneele c an d ginn als raw Datendateien zur Verfügung gestallt.
Fir d'Roll vun αS an dësem LLPS Prozess ze testen, ënnersicht mir éischt den Effet vun αS op droplet Stabilitéit vun nephelometry benotzt Erhéijung Konzentratioune vun NaCl (Fig. 2c).Wat méi héich d'Salzkonzentratioun an de Proben déi αS enthalen, dest méi héich d'Liichtstreetwäerter (bei 350 nm), wat d'stabiliséiere Roll vun αS an dësem LLPS System weist.En ähnlechen Effekt kann observéiert ginn andeems d'αS Konzentratioun (an dofir d'αS:Tau441 Verhältnis) op ca.10-fache Erhéijung relativ zu der Tau Konzentratioun (5 µM) (Fig. 2d).Fir ze weisen datt αS e Scaffoldprotein a Koacervaten ass, hu mir décidéiert d'Behuele vum LLPS-gestéierten Tau Mutant z'ënnersichen, deen eng negativ gelueden N-terminal Regioun fehlt (Rescht 1-150, kuckt Fig. 2e) genannt ΔNt-Tau.WF Mikroskopie an Nephelometrie bestätegt datt ΔNt-Tau selwer net LLPS erliewt huet (Fig. 2f an Ergänzungs Fig. 2d), wéi virdru gemellt 14. Wéi och ëmmer, wann αS zu Dispersiounsléisungen vun dëser ofgeschniddener Tau Variant bäigefüügt gouf, war de LLPS Prozess komplett restauréiert mat Drëpsen Dicht no bei der Drëps Dicht vu voller Gréisst Léisungen vun Tau an αS ënner ähnlechen Konditiounen a Protein Konzentratioune.Dëse Prozess kann och ënner Bedéngungen vu gerénger makromolekulärer Iwwerquälung observéiert ginn (Ergänzlech Fig. 2c).D'Roll vun der C-terminal αS Regioun, awer net seng ganz Längt, am LLPS-Prozess gouf bewisen duerch Inhibitioun vun der Drëpsbildung mat enger C-terminal ofgeschniddener αS Variant ouni Reschter 104-140 (Fig. 1a) vun der (ΔCt-) αS) Protein (Fig. 2f an Zousaz Fig. 2d).D'Kolokaliséierung vun αS an ΔNt-Tau gouf duerch konfokale Fluoreszenzmikroskopie bestätegt (Ergänzlech Fig. 1b).
Fir den LLPS Mechanismus tëscht Tau441 an αS weider ze testen, gouf eng zousätzlech Tau Variant benotzt, nämlech de gepaart Helical Filament Core (PHF) Fragment am Mikrotubule-bindende Domain (MTBD), wat wann et véier charakteristesch Widderhuelungsdomänen enthält, allgemeng och bekannt. als K18 Fragment (kuckt Fig. 2e).Et gouf viru kuerzem gemellt datt αS preferentiell un en Tau-Protein bindt, deen an engem prolinräiche Domain läit an enger Sequenz déi dem Mikrotubule-bindende Domain viraus ass.Wéi och ëmmer, ass d'PHF Regioun och räich u positiv gelueden Reschter (kuckt Figur 2e), besonnesch Lysin (15% Reschter), wat eis gefrot huet ze testen ob dës Regioun och zur Kondensatioun vum αS /Tau Komplex bäidréit.Mir observéiert datt K18 eleng net LLPS bei Konzentratioune bis zu 100 μM ënner de geteste Bedéngungen ausléise konnt (LLPS Puffer mat 15% PEG oder 20% Dextran) (Dorënner 2f).Wéi och ëmmer, wa mir 50 µM αS op 50 µM K18 bäigefüügt hunn, gouf séier Bildung vu Proteindrëpsen mat K18 an αS duerch Nephelometrie observéiert (Ergänzlech Fig. 2d) a WF Mikroskopie (Fig. 2f).Wéi erwaart, konnt ΔCt-αS net d'LLPS Verhalen vu K18 restauréieren (Fig. 2f).Mir bemierken datt αS / K18 Aggregatioun liicht méi héich Proteinkonzentratioune erfuerdert fir LLPS ze induzéieren am Verglach zum αS / ΔNt-Tau oder αS / Tau441, aner Saache sinn gläich.Dëst ass konsequent mat enger méi staarker Interaktioun vun der αS C-terminal Regioun mat dem prolineräiche Tau Domain am Verglach zum Mikrotubule-bindende Domain, wéi virdru beschriwwen 31.
Virausgesat datt ΔNt-Tau LLPS net an der Verontreiung vu αS kann ausféieren, hu mir dës Tau Variant als Modell gewielt fir αS / Tau LLPS ze charakteriséieren wéinst senger Einfachheet an LLPS Systemer mat voller Längt Tau (Isotyp, Tau441 / Tau441).mat komplexen (heterotypeschen, αS/Tau441) Aggregatiounsprozesser.Mir verglach de Grad vun der αS Aggregatioun (als Deel vum kondenséierte Phaseprotein, fαS,c) an den αS /Tau an αS /ΔNt-Tau Systemer duerch Zentrifugéierung a verspreet Phase SDS-PAGE Analyse (kuckt 2e), hu ganz ähnlech Wäerter fonnt. fir all Proteinen an der selwechter Konzentratioun.Besonnesch hu mir fαS, c 84 ± 2% an 79 ± 7% fir αS /Tau an αS /ΔNt-Tau kritt, respektiv, suggeréiert datt d'heterotypesch Interaktioun tëscht αS an tau superieur ass wéi d'Interaktioun tëscht Tau-Moleküle.tëscht.
D'Interaktioun mat verschiddene Polykationen an den Effekt vum Kondensatiounsprozess op d'αS Kinetik goufe fir d'éischt vun der Fluoreszenz Erhuelung no der Photobleechung (FRAP) Method studéiert.Mir hunn αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau an αS / pLK Koacervate getest (100 μM αS ergänzt mat 2 μM αS AF488-αS an 100 μM Tau441 oder ΔNt-Tau oder 1 mM pLK).D'Date goufen an den éischten 30 Minutten no der Vermëschung vun de Probekomponenten kritt.Vun representativ FRAP Biller (Lalumi 3a, αS /Tau441 Kondensatioun) an hir entspriechend Zäit Course Kéiren (Lalumi 3b, Zousaz Lalumi 3), kann et gesi ginn, datt αS Kinetik zu deenen vun Tau441 coacervates ganz ähnlech sinn.an ΔNt-Tau, wat vill méi séier ass mat pLK.Déi berechent Diffusiounskoeffizienten fir αS am Koacervat laut FRAP (wéi vum Kang et al. 35 beschriwwen) sinn D = 0,013 ± 0,009 µm2/s an D = 0,026 ± 0,008 µm2/s fir αS/TauS/Δ-t fir αS/Tau441 a αS/ System.pLK, Tau, an D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, respektiv (Lalumi 3c).Wéi och ëmmer, den Diffusiounskoeffizient αS an der verspreeter Phase ass e puer Uerderen vun der Gréisst méi héich wéi all kondenséiert Phasen, wéi bestëmmt duerch Fluoreszenz Korrelatiounsspektroskopie (FCS, kuckt Ergänzungsbild 3) ënner de selwechte Konditiounen (LLPS Puffer) awer an der Verontreiung vu Polykationen (D = 8 ± 4 µm2/s).Dofir gëtt d'Kinetik vun der αS Iwwersetzung wesentlech reduzéiert an de Koacervaten am Verglach zu Proteinen an der dispergéierter Phase wéinst ausgeschwatene molekulare Iwwersetzungseffekter, obwuel all Koacervate flëssegähnlech Eegeschafte während der éischter hallef Stonn no hirer Formation behalen, am Géigesaz zu der Tau Phase.méi séier Kinetik am pLK Kondensat.
a–c FRAP Analyse vun der αS Dynamik (2% AF488-labeléiert αS) an elektrostatesche Koacervaten.Vertrieder Biller vun αS /Tau441 FRAP assays an triplicate sinn an (a) gewisen, wou rout Kreeser decolorized Beräicher uginn.D'Skalabar ass 5 µm.b Duerchschnëtt FRAP Kéiren an (c) berechent Diffusiounskoeffizienten (D) fir 5-6 (N) verschidden Drëpsen aus dräi Experimenter mat 100 µM αS an equimolar Konzentratioune vun Tau441 (rout) oder ΔNt-Tau (blo) oder pLK (gréng) op zéng Mol d'Konzentratioun vun LLPS.D'Standardabweichung vun der FRAP-Kurve gëtt a schaarf Faarf gewisen.Zum Verglach gouf den Diffusiounskoeffizient αS an der verspreeter Phase an triplicate mat Fluoreszenz Korrelatiounsspektroskopie (FCS) bestëmmt (kuckt Zousazbild 3 a Methode fir méi Informatioun).d Kontinuéierlech X-Band EPR Spektrum vun 100 μM TEMPOL-122-αS am LLPS Puffer ouni Polykatioun (schwaarz) oder an der Präsenz vun 100 μM Tau441 (rout) oder ΔNt-Tau (blo) oder 1 mM pLK (gréng).Den Inset weist eng vergréissert Vue op déi staark Feldlinnen, wou déi dramatesch Ännerungen optrieden.e Bindungskurven vu 50 μM TEMPOL-122-αS mat verschiddene Polykationen an der Verontreiung vu LLPS (keng PEG).Déi reduzéiert Amplitude vun der Band III am Verglach zum Band II (IIII / III) vum normaliséierte EPR Spektrum gëtt gewisen fir d'molare Verhältnisser vun Tau441 (rout), ΔNt-Tau (blo) a pLK (gréng) ze erhéijen.Faarweg Linnen weisen fit ze Donnéeën engem rau bindender Modell mat n identesch an onofhängeg bindend Siten op all Kéier benotzt.Raw Daten ginn a Form vu Matière Datendateien zur Verfügung gestallt.
Als Ergänzung hu mir d'Dynamik vun αS a verschiddene Koacervaten ënnersicht mat der geriichtter Spin-Etikettéierung (SDSL) a kontinuéierlech Elektronen paramagnetescher Resonanz (CW-EPR).Dës Method huet sech als ganz nëtzlech bewisen fir d'Flexibilitéit an d'Dynamik vun der IDP mat enger realistescher Reschtopléisung36,37,38 ze berichten.Zu dësem Zweck hu mir Cysteinreschter an eenzel Cys Mutanten konstruéiert an d'4-Hydroxy-2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-N-Oxyl (TEMPOL) Spin Sonde benotzt.Maleimid Derivate markéieren se.Méi spezifesch hu mir TEMPOL Sonden op Positioun 122 oder 24 αS (TEMPOL-122-αS an TEMPOL-24-αS) agebaut.Am éischte Fall ziele mir d'C-terminal Regioun vum Protein, deen an der Interaktioun mat Polykationen involvéiert ass.Amplaz kann d'Positioun 24 eis Informatioun iwwer d'allgemeng Dynamik vun de Proteinen am Kondensat ginn.A béide Fäll entspriechen d'EPR-Signaler, déi fir Proteine ​​vun der dispergéierter Phase kritt goufen, mat Nitroxid-Radikale am séier bewegende Staat.No der Phase Trennung an der Präsenz vun Tau oder pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 oder ΔNt-Tau an engem Verhältnis vun 1:1 oder pLK an engem Verhältnis vun 1:10), gouf eng Erhéijung vun der relativer Peakintensitéit observéiert an EPR Spektrum vun αS.D'Verloscht Linn erweidert, wat reduzéiert αS Reorientatiounskinetik an Drëpsen am Verglach zum Protein an der verdënnter Phase bezeechent (Fig. 3d, Ergänzungs Fig. 4a).Dës Ännerunge si méi ausgeschwat op der Positioun 122. Während op der Positioun 24 d'Präsenz vu pLK net d'Kinetik vun der Sonde beaflosst, huet d'Spektrallinnform op der Positioun 122 däitlech geännert (Ergänzungsbild 4a).Wa mir versicht hunn d'Spektra op der Positioun 122 vun zwee αS / Polykatiounssystemer ze modelléieren mat dem isotropesche Modell (Ergänzungsbild 5a), déi allgemeng benotzt gëtt fir d'Dynamik vum spin-labeléierten IDP38,39 ze beschreiwen, konnte mir d'experimentell Spektra net rekonstruéieren..Spektral Simulatioun vun der Positioun vun 24 spin Géigesaz (Zousätzlech Lalumi 5a).Dëst hindeit datt et preferentiell Positiounen am Raum vun Spin Konfiguratiounen vun der C-terminal Regioun vun αS an der Präsenz vun polycations sinn.Wann Dir d'Fraktioun vun αS an der kondenséierter Phase ënner experimentellen EPR Bedéngungen berécksiichtegt (84 ± 2%, 79 ± 7%, a 47 ± 4% fir αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau, an αS / pLK, respektiv - kuckt Zousaz Fig. 2e vun Datenanalyse c), kann et gesi ginn datt d'Verbreedung, déi vun der EPR-Methode erkannt gëtt, haaptsächlech d'Interaktioun vun der C-terminalregioun vun αS mat verschiddene Polykationen an der kondenséierter Phase reflektéiert (d'Haaptännerung wann Dir TEMPOL-122- benotzt) αS), an net Protein Kondensatioun.Eng Erhéijung vun der Mikroviskositéit gëtt an der Sonde beobachtet.Wéi erwaart gouf den EPR Spektrum vum Protein ënner anerem Konditioune wéi LLPS komplett restauréiert wann 1 M NaCl an d'Mëschung hinzugefügt gouf (Ergänzlech Fig. 4b).Insgesamt suggeréieren eis Daten datt d'Verännerungen, déi vum CW-EPR festgestallt goufen, haaptsächlech d'Interaktioun vun der C-terminal Regioun vun αS mat verschiddene Polykationen an der kondenséierter Phase reflektéieren, an dës Interaktioun schéngt méi staark mat pLK ze sinn wéi mam Tau.
Fir méi strukturell Informatioun iwwer d'Proteine ​​am Koacervat ze kréien, hu mir beschloss de LLPS System mat NMR an der Léisung ze studéieren.Wéi och ëmmer, mir konnten nëmmen d'αS Fraktioun erkennen, déi an der verspreeter Phase bleift, wat wéinst enger reduzéierter Proteindynamik am Koacervat an enger dichter Phase um Enn vun der Léisung an der NMR Analyse kann sinn.Wa mir d'Struktur an d'Dynamik vum Protein analyséiert hunn, deen an der verspreeter Phase vun der LLPS Probe bleift mat NMR (Ergänzlech Fig. 5c, d), hu mir gemierkt datt d'Protein sech bal identesch behuelen an der Präsenz vu pLK an ΔNt-Tau, béid vun déi an der sekundärer Struktur an der Dynamik vum Protein-Réckgrat waren, opgedeckt duerch Experimenter iwwer sekundär chemesch Verréckelung an R1ρ Entspanung.NMR Donnéeën weisen datt den C-Terminus vun αS e wesentleche Verloscht vu konformationaler Flexibilitéit leiden, wärend seng gestéiert Natur behalen, wéi de Rescht vun der Proteinsequenz, wéinst sengen Interaktioune mat Polykationen.
Zënter datt d'CW-EPR Signalverbreedung, déi an der TEMPOL-122-αS kondenséierter Phase observéiert gëtt, d'Interaktioun vum Protein mat Polykationen reflektéiert, hu mir eng EPR Titratioun gemaach fir d'Bindungsaffinitéit vun αS zu verschiddene Polykatiounen an der Verontreiung vu LLPS ze evaluéieren (keng Akkumulation vun Buffer LLPS), suggeréiert datt d'Interaktiounen déiselwecht sinn a verdünnten a konzentréierte Phasen (wat duerch eis Donnéeën bestätegt gëtt, Ergänzungs Fig. 4a an Ergänzungs Fig. 6).D'Zil war ze gesinn, ob all Koacervate, trotz hiren allgemenge flëssegeähnlechen Eegeschaften, all ënnerierdesch differentiellt Verhalen um molekulare Niveau weisen.Wéi erwaart huet d'EPR-Spektrum mat der Erhéijung vun der Polykatiounskonzentratioun erweidert, wat eng Ofsenkung vun der molekulare Flexibilitéit reflektéiert wéinst molekulare Interaktiounen vun all Interaktiounspartner bal bis zur Sättigung (Fig. 3e, Ergänzungsbild 6).pLK erreecht dës Sättigung bei engem méi nidderegen molare Verhältnis (Polycation:αS) am Verglach zum ΔNt-Tau an Tau441.Tatsächlech huet de Verglach vun den Donnéeën mat engem geschätzte Bindungsmodell, deen n identeschen an onofhängege Bindungsplazen ugeholl huet, gewisen datt déi scheinbar Dissoziatiounskonstant vu pLK (~ 5 μM) eng Uerdnung vun der Gréisst méi niddereg ass wéi déi vun Tau441 oder ΔNt-Tau (~ 50 μM) ).µM).Och wann dëst eng rau Schätzung ass, proposéiert dëst datt αS eng méi héich Affinitéit fir méi einfach Polykatioune mat kontinuéierleche positiven Ladungsregiounen huet.Gitt dësen Ënnerscheed an der Affinitéit tëscht αS a verschiddene Polykationen, hu mir hypothetiséiert datt hir flësseg Eegeschafte mat der Zäit anescht kënne veränneren an doduerch vu verschiddene LSPT Prozesser leiden.
Mat dem héich iwwerfëllten Ëmfeld am Protein Koacervat an der Amyloid Natur vum Protein, hu mir d'Behuele vum Koacervat iwwer Zäit observéiert fir méiglech LSPT Prozesser z'entdecken.Mat Hëllef vu BF a CF Mikroskopie (Figure 4) hu mir observéiert datt αS / Tau441 zu engem groussen Deel an der Léisung coacervates, grouss Drëpsen bilden, déi d'Uewerfläch um Buedem vun der Brunn / Rutsch als voll Drëps kontaktéieren an naass ginn, wéi erwaart (Ergänzungs Fig. .7d);mir nennen dës ënnen geformte Strukturen "Proteinflotten".Dës Strukture blouf flësseg wéi se d'Fähigkeit behalen hunn ze fusionéieren (Ergänzungsbild 7b) a konnten e puer Stonnen no der LLPS ausgeléist ginn (Fig. 4 an Ergänzungsbild 7c).Mir beobachtet datt de Befeuchtungsprozess op der Uewerfläch vu hydrophilen anstatt hydrophobem Materialien favoriséiert gëtt (Ergänzungs Fig. 7a), wéi erwaart fir elektrostatesch Koacervate mat onbalancéierten Ladungen an domat héich elektrostatesch Uewerflächpotenzialer.Notamment goufen αS / ΔNt-Tau Koaleszenz a Rafting wesentlech reduzéiert, während αS / pLK Kondensater wesentlech reduzéiert goufen (Fig. 4).Wärend der kuerzer Inkubatiounszäit konnten d'αS /pLK Drëpsen d'hydrophil Uewerfläch koalescéieren an naass, awer dëse Prozess huet séier gestoppt an no 5 Stonnen Inkubatioun goufen nëmme limitéiert Koaleszenzevenementer a keng Befeuchtung observéiert.- Gel-Drip Iwwergank.
Représentant BF (Greyscale Panels) a CF (riets Panels, AF488-labeléiert αS a gréng) vu Koacervatproben mat 100 µM αS (1% fluoreszent Label) am LLPS Puffer an der Präsenz vun 100 µM Tau441 (Top) fluoreszenz Biller ΔN -Tau (Zentrum) oder 1 mM pLK (ënnen) bei verschiddenen Inkubatiounszäiten a Brennwäit (z, Distanz vun ënnen vun der Plack gutt).D'Experimenter goufen 4-6 Mol onofhängeg vuneneen widderholl mat de selwechte Resultater.αS/Tau441 Koacervate ginn no 24 Stonnen befeucht, a bilden Floss méi grouss wéi d'Bild.D'Skalabar fir all Biller ass 20 µm.
Mir hunn dunn gefrot ob déi grouss flëssegähnlech Proteinpools geformt an αS /Tau441 LLPS zu Amyloidaggregatioun vun engem vun de studéierte Proteinen féieren.Mir gefollegt der maturation vun αS /Tau441 droplets iwwer Zäit mat WF microscopy ënnert déi selwecht Konditiounen wéi uewen, mä benotzt 1 μM AF488-Label αS an Atto647N-Label Tau441 (Figebam. 5a).Wéi erwaart hu mir eng komplett Proteinlokaliséierung am ganzen Reifungsprozess observéiert.Interessanterweis vun ca.No 5 Stonnen goufen méi intensiv net-kreesfërmeg Strukturen an de Flotten observéiert, déi mir "Punkten" genannt hunn, e puer vun deenen mat αS kolokaliséiert goufen, an e puer an Tau441 beräichert (Fig. 5a, wäiss Pfeile).Dës Flecken sinn ëmmer a Flotten a méi grousser Ausmooss fir αS / ΔNt-Tau observéiert wéi fir αS / ΔNt-Tau.Et waren keng markant Flecken an den Drëpsen vun pLK an Tau Systemer inkompetent fir Fusioun / Befeuchtung.Fir ze testen ob dës Flecken mat αS an Tau441 Amyloid-ähnlechen Aggregate sinn, hu mir en ähnlechen Experiment mat CF Mikroskopie gemaach, an där Tau441 mat Atto647N markéiert gouf an 12,5 μM Amyloid-spezifesch Thioflavin-T (ThT) gouf vun Ufank u bäigefüügt.Faarf.Obwuel ThT-staining vun αS /Tau441 Drëpsen oder flott war net observéiert och no 24 h vun incubation (Figebam. 5b, Top Zeil-bleiwen Tropfen iwwer Protein flotten), ThT-positiv Strukturen mat Atto647N-Tau441 bannent der flott waren ganz schwaach.dëst replizéiert d'Gréisst, d'Form an d'Plaz vun de virdru beschriwwene Flecken (Fig. 5b, Mëtt an ënnen Zeilen), suggeréiert datt d'Flecken mat Amyloid-ähnlechen Aggregaten entspriechen, déi an alternd Flëssegkoacervate geformt sinn.
WF 25 μM αS bei verschiddenen Inkubatiounszäiten a Brennwäit (z, Distanz vun ongebonnenen ënnen) a Präsenz vu 25 μM Tau441 (1 μM AF488-labeléiert αS an Atto647N-labeléiert Tau441) an enger Well vun enger Mikroskopplack mat LLPS-Puffer) .Sechs Experimenter goufen onofhängeg mat ähnlechen Resultater widderholl.b CF mikroskopescht Bild vu 25 μM αS a Präsenz vu 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-Label Tau441) an 12,5 μM Thioflavin-T (ThT).Gewiicht Proteindrëpsen an deposéiert Proteinflotten a Flecken ginn an der ieweschter a mëttlerer Reihen respektiv gewisen.Déi ënnescht Zeil weist Biller vu Flotten a Tropfen aus 3 onofhängege Replikate.Wäiss Pfeile weisen ThT-positiv Punkten op béide Panelen un.D'Skalabar fir all Biller ass 20 µm.
Fir méi detailléiert d'Verännerungen am Coacervate Proteinnetz beim Iwwergang vu flëssege bis fest ze ënnersichen, hu mir Fluoreszenz Liewensdauer Imaging (FLIM) a Förster Resonanzenergietransfermikroskopie (FRET) (Dorënner 6 an Ergänzungsfiguren 8 an 9) benotzt.Mir hunn hypothetiséiert datt d'Koacervat Reifung vun der Schicht zu enger méi kondenséierter oder souguer zoliddähnlech aggregéierter Proteinstruktur zu méi enke Kontakt tëscht dem Protein an der fluoreszenter Sonde, déi dermat verbonnen ass, féiert, potenziell e Quenching Effekt ze produzéieren manifestéiert an enger verkierzter Sonde Liewensdauer (τ) , wéi virdru beschriwwen40.,41,42.Zousätzlech, fir duebel Label Echantillon (AF488 an Atto647N als FRET Donor an acceptor Faarfstoffer, respektiv), kann dës Ofsenkung vun τ och vun coacervate Kondensatioun an eng Erhéijung vun FRET (E) Effizienz während LSPT begleet ginn.Mir iwwerwaacht Flott a Fleckbildung iwwer Zäit an LLPS αS / Tau441 an αS / ΔNt-Tau Proben (25 µM vun all Protein am LLPS Puffer mat 1 µM AF488 markéiert αS an / oder Atto647N mam Label Tau441 oder ΔNt-Tau).Mir hunn en allgemengen Trend observéiert datt d'Fluoreszenz Liewensdauer vun den AF488 (τ488) an Atto647N (τ647N) Sonden liicht erofgaange sinn wéi d'Koacervate reift (Figebam. 6 an Zousaz Lalumi 8c).Interessanterweis gouf dës Ännerung wesentlech verbessert fir Punkte bannent Flotten (Fig. 6c), wat beweist datt weider Proteinkondensatioun bei Punkte geschitt ass.Fir dëst z'ënnerstëtzen, gouf keng bedeitend Ännerung vun der Fluoreszenz Liewensdauer fir αS / ΔNt-Tau Drëpsen observéiert déi fir 24 h al sinn (Ergänzungs Fig. 8d), wat suggeréiert datt d'Drëpsgelatioun e Prozess ass ënnerscheet vu Flecken an deen net vu bedeitende molekulare Reorganisatioun begleet gëtt. bannent coacervates.Et sollt bemierkt datt d'Punkte verschidde Gréissten a variabelen Inhalt an αS hunn, besonnesch fir den αS / Tau441 System (Ergänzungs Fig. 8e).D'Ofsenkung vun der Fleckfluoreszenz Liewensdauer gouf vun enger Erhéijung vun der Intensitéit begleet, besonnesch fir Atto647N mam Label Tau441 (Supplementary Fig. 8a), a méi héich FRET Effizienz fir béid αS/Tau441 an αS/ΔNt-Tau Systemer, wat weider Kondensatioun an LLPS Fënnef Stonnen beweist. no Ausléiser, d'Proteine ​​bannent der statesch Elektrizitéit kondenséiert.Am Verglach mam αS / ΔNt-Tau hu mir méi niddereg τ647N an e bësse méi héich τ488 Wäerter an αS / Tau441 Flecken observéiert, begleet vu méi nidderegen a méi inhomogenen FRET Wäerter.Méiglech, kann dëst mat der Tatsaach Zesummenhang sinn, datt am αS / Tau441 System, der observéiert an erwaart αS Heefegkeet an Aggregaten méi heterogen ass, dacks substoichiometresch Verglach zu Tau, well Tau441 selwer kann och LLPS an Aggregatioun erliewen (Ergänzungs Fig. 8e) .Wéi och ëmmer, de Grad vun der Drëpsenkoaleszenz, der Flottbildung, an, Wichteg, Proteinaggregatioun bannent flëssegähnleche Koacervaten ass maximal wa béid Tau441 an αS präsent sinn.
a Lifetime Fluoreszenzmikroskopie (FLIM) Biller vun αS / Tau441 an αS / ΔNt-Tau bei 25 μM vun all Protein (1 μM AF488-labeléiert αS an 1 μM Atto647N-label Tau441 oder ΔNtLLPS-Puffer).D'Saile weisen representativ Biller vun LLPS Echantillon bei verschiddene Reifungszäiten (30 min, 5 h an 24 h).De roude Kader weist d'Regioun mat αS / Tau441 Flecken.D'Liewensdauer ginn als Faarfbalken ugewisen.Skala Bar = 20 µm fir all Biller.b Verzoomt FLIM Bild vum ausgewielten Gebitt, an der rouder Këscht am Panel a gewisen.Liewensberäicher gi mat der selwechter Faarfskala gewisen wéi am Panel a.Skala Bar = 5 µm.c Histogramme weisen AF488 (befestegt un αS) oder Atto647N (befestegt un Tau) fir verschidde Proteinaarten (Drëpsen-D-, Raft-R- a Speckle-P) identifizéiert a FLIM Biller opgeholl fir αS-) Timing Verdeelungen Liewensdauer vun Tau441 an αS / ΔNt-Tau coacervate Echantillon (N = 17-32 ROI fir D, 29-44 ROI fir R, an 21-51 ROI fir Punkten).Mëttel- a Medianwäerter ginn als giel Quadraten a schwaarz Linnen a Këschte respektiv gewisen.Déi ënnescht an iewescht Grenze vun der Këscht representéieren déi éischt an drëtt Quartil, respektiv, an d'Mindest- a Maximalwäerter am 1,5-fache Interquartile-Beräich (IQR) ginn als Whiskers gewisen.Outliers ginn als schwaarz Diamanten gewisen.Statistesch Bedeitung tëscht Puer vun distributions war mat engem zwee-Prouf T-Test bestëmmt, unhuelen ongläiche Varianzen.Zwee-tailed t-Test p-Wäerter gi mat Asterisken fir all Paar vergläicht Daten ugewisen (* p-Wäert > 0,01, ** p-Wäert > 0,001, *** p-Wäert > 0,0001, **** p-Wäert > 0,00001), ns Gëtt Vernoléissegkeet un (p-Wäert > 0,05).Déi exakt p Wäerter ginn an der Ergänzungstabell 1 uginn, an déi ursprénglech Donnéeën ginn als raw Datedateien presentéiert.
Fir weider d'amyloid-ähnlech Natur vu Flecken / Aggregaten ze demonstréieren, hu mir onbeschiedegt Koacervate Proben fir 24 Stonnen mat héije Konzentratioune vu (1 M) NaCl behandelt, wat zu der Trennung vun Aggregaten aus Proteinkoacervate gefouert huet.Wann isoléiert Aggregaten (dh eng verspreet Léisung vun Aggregaten) mat Atomkraaftmikroskopie (AFM) observéiert goufen, hu mir eng haaptsächlech kugelfërmeg Morphologie mat enger regulärer Héicht vu ronn 15 nm observéiert, déi tendéiert ënner Bedéngungen vun héijer Salzkonzentratioun ze associéieren, ähnlech wéi d'Behuele vun typeschen Amyloid Fibrillen wéinst dem staarken hydrophobesche Effekt op der Uewerfläch (Bemierkung datt Fibrillen typesch eng Héicht vu ~10 nm hunn) (Ergänzlech Fig. 10a).Interessanterweis, wann isoléiert Aggregaten mat ThT an engem Standard ThT Fluoreszenz Assay inkubéiert goufen, hu mir eng dramatesch Erhéijung vun der ThT Fluoreszenz Quante Rendement observéiert, vergläichbar mat deem observéiert wann de Faarfstoff mat typesche αS Amyloid Fibrillen inkubéiert gouf (Ergänzungs Fig. 10b), suggeréiert datt d'Koacervataggregate enthalen amyloidähnleche Strukturen..Tatsächlech waren d'Aggregate tolerant fir héich Salzkonzentratioune awer empfindlech op 4 M Guanidinchlorid (GdnHCl), wéi typesch Amyloidfibrillen (Ergänzungs Fig. 10c).
Als nächst analyséiere mir d'Zesummesetzung vun den Aggregaten mat eenzel Molekülfluoreszenz, spezifesch Fluoreszenz Korrelatioun / Kräiz-Korrelatiounsspektroskopie (FCS /FCCS), a Burstanalyse vun zwee-Faarf Zoufallserkennung (TCCD).Zu dësem Zweck, isoléiert mir Aggregate geformt no 24 Stonnen vun incubation an 100 μl LLPS Echantillon mat αS an Tau441 (béid 25 μM) zesumme mat 1 μM AF488-Label αS an 1 μM Atto647N-Label Tau441.Verdünnt déi resultéierend dispergéiert Aggregatléisung zu engem monomolekuläre Staat mat deemselwechte PEG-fräie Puffer an 1 M NaCl (deeselwechte Puffer benotzt fir Aggregaten aus Koacervate ze trennen) fir eventuell elektrostatesch Interaktiounen tëscht LLPS a Protein ze vermeiden.E Beispill vun der Zäit Trajectoire vun engem eenzege Molekül kann an Fig.. 7a gesi ginn.FCCS /FCS Analyse (Kräizkorrelatioun, CC an Autokorrelatioun, AC) huet gewisen datt Aggregaten déi αS an tau enthalen an de Proben reichend waren (kuckt CC Curve an der Fig. Resultat vum Verdünnungsprozess (kuckt AC Kurven an der Figur 7b, lénks Panel).Kontroll Experimenter ënner der selwechter Léisung Konditiounen gesuergt Echantillon mat nëmmen monomeric Proteinen enthale keng CC Kéiren gewisen, an der AC Kéiren fit gutt mat der eent-Komponent Diffusioun Modell (Eq. 4), wou monomeric Proteinen déi erwaart Diffusioun Koeffizienten hunn (Figebam. 7b). ), riets Panel).Den Diffusiounskoeffizient vun aggregéierten Partikel ass manner wéi 1 µm2 / s, an dee vu monomere Proteinen ass ongeféier 1 µm2 / s.50-100 µm/s;Wäerter sinn ähnlech wéi virdru publizéiert Wäerter fir sonicated αS Amyloid Fibrillen a monomer αS separat ënner ähnlechen Léisungsbedéngungen44.Wa mir d'Aggregate mat TCCD Explosiounsanalyse analyséiert hunn (Fig. 7c, Top Panel), hu mir festgestallt datt an all isoléierten Aggregat (αS /Tau heteroaggregate), ongeféier 60% vun den entdeckten Aggregate souwuel αS wéi och Tau enthalen, ongeféier 30% enthalen nëmmen tau, ongeféier 10% nëmmen αS.Stoichiometresch Analyse vun αS /Tau Heteroaggregaten huet gewisen datt déi meescht Heteroaggregate am Tau beräichert goufen (stoichiometrie ënner 0,5, d'Duerchschnëttszuel vun Tau Molekülle pro Aggregat ass 4 Mol méi wéi αS Molekülle), wat konsequent mat eiser Aarbecht ass, déi am FLIM in situ observéiert ass. Experimenter..FRET Analyse huet gewisen datt dës Aggregate béid Proteine ​​enthalen, obwuel déi aktuell FRET Wäerter an dësem Fall net vu grousser Wichtegkeet sinn, well d'Verdeelung vu Fluorophoren an all Aggregat zoufälleg war wéinst engem Iwwerschoss vun unlabeled Protein am Experiment benotzt.Interessanterweis, wa mir déiselwecht Analyse gemaach hunn mat der 45,46 reife Amyloid Aggregatioun-defiziter Tau Variant (kuckt Zousaz Fig. 11a, b), hu mir gemierkt datt obwuel d'αS elektrostatesch Aggregatioun d'selwecht war (Supplementary Fig. 11c, d), d'Kapazitéit fir Aggregaten am Koacervat ze bilden gouf drastesch reduzéiert an FLIM huet verschidde Flecken an in situ Experimenter entdeckt, a schwaach Kräizkorrelatiounskurven goufen fir isoléiert Aggregatproben observéiert.Wéi och ëmmer, fir eng kleng Unzuel vun detektéierten Aggregaten (nëmmen een Zéngtel vun Tau441), hu mir observéiert datt all Aggregat an αS beräichert gouf wéi dës Tau Variant, mat ongeféier 50% vun den entdeckten Aggregaten déi nëmmen αS Moleküle enthalen, an αS war heterogen am Iwwerschoss. .aggregéiert (kuckt Zousaz Lalumi 11e), am Géigesaz zu den heterogenen aggregéiert vun Tau441 generéiert (Fig. 6f).D'Resultater vun dësen Experimenter weisen datt obwuel αS selwer fäeg ass mat Tau am Koacervat ze accumuléieren, Tau Nukleatioun ass méi gënschteg ënner dëse Bedéngungen, an déi resultéierend amyloidähnlech Aggregate kënnen als Form vun αS an tau handelen.Wéi och ëmmer, wann en tau-räiche Kär geformt ass, ginn heterotypesch Interaktiounen tëscht αS an tau an Aggregate favoriséiert iwwer homotypesch Interaktiounen tëscht Tau-Moleküle;Mir beobachten och Proteinnetzwierker a flëssege αS / tau Koacervate.
e Vertrieder Fluoreszenz temporär Spure vun eenzelne Moleküle vun isoléierten Aggregaten, déi an αS / Tau441 elektrostatesche Koacervate geformt sinn.Bursts entspriechend αS /Tau441 coaggregates (bursts iwwer der ugewisen Schwell) goufen an dräi Detektioun Channels observéiert (AF488 an Atto647N Emissioun no direkter excitation, blo a rout Linnen, Atto647N Emissioun no indirekten excitation), FRET, violett Linn).b FCS /FCCS Analyse vun enger Probe vun isoléierten αS /Tau441 Aggregaten aus LLPS (lénks Panel) kritt.Autokorrelatioun (AC) Kéiren fir AF488 an Atto647N ginn a blo a rout gezeechent, respektiv, a Kräizkorrelatioun (CC) Kéiren verbonne mat Aggregaten, déi béid Faarfstoffer enthalen, ginn a violett gewisen.D'AC-Kéiren reflektéieren d'Präsenz vu markéierte monomeren an aggregéierte Proteinaarten, während d'CC-Kéiren nëmmen d'Diffusioun vun duebel-labeléierten Aggregate weisen.Déi selwecht Analyse, awer ënner de selwechte Léisungsbedéngungen wéi an isoléierte Flecken, Proben, déi nëmmen monomer αS an Tau441 enthalen, ginn als Kontrollen an der rietser Panel gewisen.c Fluoreszenz Flash Analyse vun eenzelne Molekülle vun isoléierten Aggregaten geformt an αS / Tau441 elektrostatesche Koacervate.Informatioun fir all Aggregat fonnt a véier verschiddene Wiederholungen (N = 152) gëtt géint hir Stoichiometrie, S Wäerter a FRET Effizienz geplot (Top Panel, Faarfbar reflektéiert Optriede).Dräi Aarte vun Aggregaten kënnen ënnerscheeden: -αS-nëmmen Aggregaten mat S~1 a FRET~0, Tau-nëmmen Aggregaten mat S~0 a FRET~1, an heterogen Tau/αS Aggregaten mat Zwëschen S a FRET Schätzunge vum Betrag vu béide Markerproteine, déi an all heterogenen Aggregat festgestallt goufen (N = 100) ginn an der ënneschter Panel gewisen (d'Faarfskala reflektéiert d'Optriede).Raw Daten ginn a Form vu Matière Datendateien zur Verfügung gestallt.
D'Reifung oder d'Alterung vu flëssege Proteinkondensate an gelähnlechen oder festen Strukturen iwwer Zäit gouf gemellt datt se a verschiddene physiologesche Funktiounen vum Kondensat47 involvéiert sinn wéi och an der Krankheet, als en anormale Prozess virum Amyloidaggregatioun 7, 48, 49. mir studéieren Phase Trennung a Verhalen am Detail.LSPT αS an der Präsenz vun zoufälleg Polycations an engem kontrolléierten Ëmfeld bei nidderegen mikromolar Konzentratioune a physiologesch relevante Konditiounen (Notiz datt déi berechent physiologesch Konzentratioun vun αS> 1 µM50 ass), no typesch thermodynamesch gedriwwe Verhalen vun LPS.Mir hunn erausfonnt datt αS, déi eng héich negativ gelueden C-terminal Regioun um physiologeschen pH enthält, fäeg ass Protein-räich Drëpsen an wässerlecher Léisung iwwer LLPS ze bilden an der Präsenz vun héich kationesche gestéiert Peptiden wéi pLK oder Tau duerch de Prozess vun elektrostatescher komplex Kondensatioun an der Präsenz vun Aggregatiounsmakromolekülen.Dëse Prozess kann relevant Effekter am celluläre Ëmfeld hunn, wou αS verschidde polykationesch Moleküle begéint, déi mat senger Krankheet assoziéierter Aggregatioun assoziéiert sinn, souwuel in vitro wéi och in vivo51,52,53,54.
A ville Studien gouf Proteindynamik bannent Drëpsen als ee vun de Schlësselfaktoren ugesinn, déi de Reifungsprozess bestëmmen55,56.An elektrostatesche αS Koacervate mat Polykationen hänkt de Reifungsprozess anscheinend vun der Stäerkt vun Interaktiounen mat Polykationen, der Valenz an der Villfalt vun dësen Interaktiounen of.Gläichgewiicht Theorie suggeréiert datt eng Gläichgewiicht Landschaft vun zwee flëssege Staaten d'Präsenz vun engem groussen Tropfen räich u Biopolymeren wier, déi LLPS57,58 fueren.Drëpswachstum kann duerch Ostwald Reifung59, Koaleszenz60 oder Konsum vu fräie Monomer an der verspreeter Phase61 erreecht ginn.Fir αS an Tau441, ΔNt-Tau oder pLK, gouf de gréissten Deel vum Protein am Kondensat konzentréiert ënner de Bedéngungen, déi an dëser Etude benotzt goufen.Wéi och ëmmer, wärend Tau Drëpsen a voller Gréisst séier op Uewerflächebefeuchtung koaleséiert hunn, waren d'Drëpskoaleszenz a Bewässerung schwéier fir ΔNt-Tau a pLK, wat e schnelle Verloscht vu Flëssegkeetseigenschaften an dësen zwee Systemer suggeréiert.No eiser FLIM-FRET Analyse hunn déi al pLK an ΔNt-Tau Drëpsen en ähnleche Grad vu Proteinaggregatioun gewisen (ähnlech Fluoreszenz Liewensdauer) wéi déi ursprénglech Drëpsen, suggeréiert datt dat ursprénglecht Proteinnetz behalen gouf, och wann méi steif.
Mir rationaliséieren eis experimentell Resultater am folgende Modell (Dorënner 8).Déi ursprénglech temporär geformt Drëpsen sinn dacks Proteinnetzwierker ouni elektrostatesch Kompensatioun, an doduerch ginn et Gebidder vun der Ladungsunbalance, besonnesch um Drëpsen-Interface, wat zu Drëpsen mat engem héije elektrostatesche Uewerflächpotenzial resultéiert.Fir Ladung ze kompenséieren (e Phänomen, deen allgemeng als Valenzverarmung bezeechent gëtt) an d'Uewerflächpotenzial vun den Drëpsen ze minimiséieren, kënnen d'Drëpsen nei Polypeptiden aus der verdënnter Phase enthalen, Proteinnetzwierker reorganiséieren fir Charge-Lade-Interaktiounen ze optimiséieren, a mat anere Drëpsen interagéieren.mat Flächen (Befeuchtung).D'αS / pLK Drëpsen, wéinst hirem méi einfache Proteinnetz (nëmmen heterotypesch Interaktiounen tëscht αS a pLK) a méi grousser Affinitéit fir Protein-Protein Interaktiounen, schéngen d'Laascht vum Kondensat méi séier ze balanséieren;Tatsächlech hu mir méi séier Proteinkinetik an ufanks geformte αS / pLK Koacervaten observéiert wéi an αS /Tau.No der Valenzverschmotzung ginn d'Interaktioune manner ephemeral an d'Drëpsen verléieren hir flësseg Eegeschaften a verwandelen sech zu gelähnlechen, net brennbaren Drëpsen mat engem nidderegen elektrostatesche Uewerflächpotential (an dofir net fäeg d'Uewerfläch ze naassen).Am Géigesaz, sinn αS / Tau Tropfen manner effizient fir d'Drëpsladungsbalance ze optimiséieren wéinst méi komplexe Proteinnetzwierker (mat béid homotypeschen an heterotypeschen Interaktiounen) an der méi schwaacher Natur vu Proteininteraktiounen.Dëst resultéiert an Drëpsen, déi flësseg Verhalen fir länger Zäit behalen an en héicht elektrostatescht Uewerflächpotenzial ausweisen, dat tendéiert miniméiert ze ginn andeems se koalescéieren a wuessen (also d'Uewerfläch/Volumenverhältnis vun den Drëpsen miniméieren) an duerch d'Bewässerung vun der hydrophiler Uewerflächchemie.Dëst erstellt grouss konzentréiert Proteinbibliothéiken déi flësseg Eegeschafte behalen well d'Interaktioune ganz transient bleiwen wéinst der konstanter Sich no Ladungsoptimiséierung am Proteinnetz.Interessanterweis weisen N-terminal ofgeschnidden Forme vun Tau, dorënner e puer natierlech optrieden Isoformen62, Zwëschenverhalen, mat e puer Koacervaten alternd mat αS a laangliewege gelähnlechen Drëpsen, während anerer a grousse flëssege Kondensater transforméieren.Dës Dualitéit an der Reifung vun αS elektrostatesche Koacervaten ass konsequent mat rezenten LLPS theoreteschen an experimentellen Studien, déi eng Korrelatioun tëscht Valenzverschmotzung an elektrostatesche Seifen a Kondensater identifizéiert hunn als Schlëssel fir d'Kondensatgréisst a Flëssegkeetseigenschaften ze kontrolléieren.Mechanismus 58.61.
Dëse Schema weist de putative Amyloid Aggregatiounswee fir αS an Tau441 iwwer LLPS an LSPT.Mat zousätzlech anion-räich (rout) a kation-räich (blo) Regiounen, αS an tau elektrostatesch coacervates mat zefriddestellend Valenz hunn manner Uewerfläch Energie an domat manner coalescence, doraus zu rapid dropset alternd.E stabile net-agglomeréierte Gelzoustand gëtt erreecht..Dës Situatioun ass ganz gënschteg am Fall vum αS / pLK System wéinst senger méi héijer Affinitéit a méi einfacher Protein-Paar Interaktiounsnetz, wat e schnelle gelähnlechen Iwwergang erlaabt.Am Géigendeel, Drëpsen mat onzefriddenstellend Valenz an dofir Protein-gelueden Regiounen verfügbar fir Interaktioun, maachen et méi einfach fir d'Koacervate d'hydrophil Uewerfläch ze fusionéieren an ze naass fir seng héich Uewerflächenergie ze reduzéieren.Dës Situatioun ass bevorzugt fir αS / Tau441 Koacervaten, déi e multivalent komplext Netzwierk besteet aus schwaache Tau-Tau an αS-Tau Interaktiounen.Am Tour wäerte méi grouss Koacervate méi liicht hir flëssegähnlech Eegeschafte behalen, wat aner Protein-zu-Protein Interaktiounen erlaabt.Eventuell amyloid heterogen Aggregaten, déi souwuel αS wéi och Tau enthalen, bilden an der Koacervatflëssegkeet, déi mat deenen, déi an Inklusiounskierper fonnt goufen, verbonne sinn, déi Zeeche vun neurodegenerativen Krankheeten sinn.
Déi grouss flëssegähnlech Strukture geformt wärend der Reifung vun αS / Tau441 mat engem héich iwwerlaascht awer dynamesche Proteinëmfeld an, a mannerem Ausmooss, αS / ΔNt-Tau Koacervate sinn ideal Reservoir fir d'Nukleatioun vun der Proteinaggregatioun.Mir hunn tatsächlech d'Bildung vu festen Proteinaggregaten an dëser Aart vu Proteinkoacervate observéiert, dacks souwuel αS wéi och Tau enthalen.Mir hu gewisen datt dës Heteroaggregate stabiliséiert ginn duerch net-elektrostatesch Interaktiounen, fäeg sinn amyloid-spezifesch ThT-Faarwen op déiselwecht Manéier ze binden wéi typesch Amyloidfibrillen, an hunn tatsächlech ähnlech Resistenz géint verschidden Aflëss.D'αS /tau Aggregate geformt vun LLPS goufen ugewisen amyloid-ähnlechen Eegeschaften ze hunn.Tatsächlech ass déi reife Variant vum Tau defizitéierter Amyloid Aggregatioun wesentlech behënnert an der Bildung vun dësen heterogenen αS Aggregaten am flëssege elektrostatesche Koacervat.D'Bildung vun αS /Tau441 Aggregaten gouf nëmmen an de Koacervaten observéiert, déi flëssegähnlech Eegeschafte behalen hunn, an ni, wann d'Koacervaten / Drëpsen net de Gel-Staat erreecht hunn.Am leschte Fall verhënnert d'erhéite Stäerkt vun elektrostateschen Interaktiounen an als Resultat d'Steifheet vum Proteinnetz déi néideg konformational Ëmännerunge vu Proteinen fir nei Proteininteraktiounen ze etabléieren, déi néideg sinn fir Amyloid Nukleatioun.Wéi och ëmmer, dëst kann a méi flexibel, flëssegähnlech Koacervate erreecht ginn, déi am Tour méi wahrscheinlech flësseg bleiwen wéi se an der Gréisst eropgoen.
D'Tatsaach datt d'Bildung vun Aggregaten an der kondenséierter Phase léiwer a grousse αS / Tau Kondensater ass wéi a klenge Tropfen déi séier geléieren, beliicht d'Relevanz vun der Identifikatioun vun de Faktoren déi d'Drëpskoaleszenz kontrolléieren.Also ass et net nëmmen eng Tendenz fir Phase Trennung, mee d'Gréisst vum Kondensat muss kontrolléiert ginn fir e gudde Fonctionnement souwéi Krankheet Präventioun58,61.Eis Resultater ënnersträichen och d'Wichtegkeet vum Gläichgewiicht tëscht LLPS an LSPT fir den αS /Tau System.Wärend Drëpsbildung géint Amyloid Aggregatioun schützen kann andeems d'Quantitéit u Proteinmonomeren verfügbar ënner Sättigungsbedéngungen reduzéiert, wéi an anere Systemer proposéiert gouf63,64, Drëpsfusioun bei héijen Drëpsniveauen kann zu enger interner Proteinaggregatioun duerch lues konformational Ëmännerungen féieren.Protein Netzwierker..
Insgesamt ënnersträichen eis Daten staark d'Relevanz vun der kohäsiver Valenz an zefridden / onzefriddenen Interaktiounen an Drop-Netzwierker am Kontext vun der LSPT.Besonnesch weisen mir datt voll Längt αS / Tau441 Kondensater fäeg sinn effizient ze fusionéieren an ze nukleéieren fir amyloidähnlech Heteroaggregaten ze bilden déi béid Proteinen enthalen an e molekulare Mechanismus proposéieren op Basis vun eisen experimentellen Resultater.D'Ko-Aggregatioun vun zwee Proteinen am αS /Tau Flëssegkeets-Koacervat, dat mir hei berichten, kann tatsächlech mat der Co-Lokaliséierung vun zwee Proteinen an Inklusiounen verbonne sinn, déi Markenzeeche vun der Krankheet sinn, a kënnen dozou bäidroen fir d'Relatioun tëscht LLPS an LLPS ze verstoen. Amyloid Aggregatioun, de Wee fir héich gelueden IDP an der Neurodegeneratioun ausgemaach.
Monomer WT-αS, Cysteinmutanten (Q24C-αS, N122C-αS) an ΔCt-αS Varianten (Δ101-140) goufen an E. coli ausgedréckt a gereinegt wéi virdru beschriwwen.5 mM DTT gouf an all Schrëtt an der Reinigung vun αS Cystein Mutanten abegraff fir d'Disulfidbindungsbildung ze vermeiden.Tau441 Isoform (Plasmid kritt vum Addgene #16316), ΔNt-Tau Variant (Δ1-150, kritt duerch Klonen vun IVA mat Primer CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) an AggDef-2CT,5C purifizéiert Variant mat EGGDef-1CT,5C Purified. coli Kulturen waren ugebaut ze OD600 = 0,6-0,7 bei 37 ° C an 180 RPM-, an Ausdrock war mat IPTG fir 3 Stonnen bei 37 ° C entschlof.Recolte Zellen bei 11.500 xg fir 15 min bei 4 ° C a wäschen mat Salins Puffer mat 150 mM NaCl.Resuspendéiert de Pellet am Lysisbuffer (20 ml pro 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, Benzamidin 50 μM, Copeptin 100).De Sonication Schrëtt gouf op Äis mat enger Amplitude vun 80% fir 10 Impulser (1 min op, 1 min aus) gemaach.Maacht net méi wéi 60 ml an engem Ultraschall.E. coli lysates sech bei 95 ° C fir 20 Minutten erhëtzt, dann op Äis ofkillt an centrifuged bei 127.000 × g fir 40 Minutten.De gekläerte Supernatant gouf op eng 3,5 kDa Membran (Spectrum ™ Thermo Fisher Scientific, UK) applizéiert an dialyséiert géint 4 L Dialysebuffer (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM) PMSF 0,1 mM) fir 10 Stonnen.Eng 5 ml Kationaustauschkolonn (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) gouf mat Equilibratiounsbuffer (20 mm MES, pH 6,8, 50 mm NaCl, 1 mm EDTA, 2 mm MgCl2, 2 mm DTT, 0,1 mm PMSF) ausgeglach.Den Tau-Lysat gouf duerch en 0,22 μm PVDF-Filter gefiltert an an d'Kolonn mat enger Flowrate vun 1 ml / min injizéiert.Elutioun gouf graduell duerchgefouert, tau gouf mat 15-30% Elutiounsbuffer (20 mm MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mm EDTA, 2 mm MgCl2, 2 mm DTT, 0,1 mm PMSF) eluéiert.Fraktiounen goufen duerch SDS-PAGE analyséiert, an all Fraktiounen, déi eng Band mat dem erwaarten Molekulargewiicht vun Tau enthalen, goufen konzentréiert mat engem 10 kDa Zentrifugefilter a mat engem Puffer ersat mat 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM an DTT 2 mM fir déi lescht Protein Konzentratioun war 100 μM.D'Proteinléisung gouf dunn duerch en 0,22 μm PVDF-Filter passéiert, séier gefruer a bei -80 ° C gelagert.Protein K18 gouf frëndlech vum Prof Alberto Boffi geliwwert.D'Rengheet vun der Virbereedung war> 95% wéi vun SDS-PAGE a MALDI-TOF /TOF bestätegt.Verschidde Cysteine ​​goufen chemesch mat AlexaFluor488-Maleimid (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) oder TEMPOL-Maleimid (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada) markéiert.goufen duerch absorbance an MALDI-TOF / TOF bestätegt.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau a K18 goufen mat gebiertege Cysteinreschter op Positiounen 191 an 322 mat Atto647N-Maleimid (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Däitschland) no der selwechter Prozedur markéiert.Netto charge pro Rescht Kaarte fir αS an Tau441 sech mat CIDER66 generéiert.
Fest Poly-L-Lysin (pLK DP 90-110 laut NMR vum Fournisseur, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) gouf an 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 bis 10 mM Konzentratioun opgeléist, Prozess sonicated fir 5 Minutten an engem Ultraschallwasserbad a späichere bei -20°C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) an FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) si Waasserléislech a wäit an LLPS Puffer verdeelt.Dialyse läscht kontaminéiert Salzer.Si goufen dann duerch eng Sprëtzfilter mat enger Poregréisst vun 0,22 μm gefiltert, an hir Konzentratioune goufen mat engem Refraktometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA) berechent.LLPS Proben goufen bei Raumtemperatur an der folgender Uerdnung virbereet: Puffer an Extrusioun goufen gemëscht an 1 mM Tris(2-Carboxyethyl)phosphin (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethan- 1, 2-Diyldinitril) Tetraacetic Seier (EDTA, Carboxynth) an eng Mëschung aus 1% Protease inhibitor (PMSF 100 mM, Benzimid 1 mM, Leupeptin 5 μM).Da ginn αS a verschmolzene Polykationen (Optiounen pLK oder Tau) derbäi.Fir Thioflavin-T Zäitserieexperimenter (ThT, Carbosynth, Compton, UK), benotzt d'total ThT Konzentratioun fir d'Halschent vun der αS Konzentratioun ze sinn.D'Proben sanft awer grëndlech vermëschen fir sécherzestellen datt se homogen sinn.D'Konzentratioun vun all Komponent variéiert vun Experiment zu Experiment, wéi an der Resultater Sektioun beschriwwen.Azide gouf bei enger Konzentratioun vun 0,02% (w/v) benotzt wann d'Dauer vum Experiment 4 Stonnen iwwerschratt ass.Fir all Analyse mat LLPS Proben, erlaabt d'Mëschung fir 5 Minutte virun der Analyse ze equilibréieren.Fir d'Liichtstreetanalyse goufen 150 μl Proben op net-bindend 96-Well Mikroplacke gelueden (μClear®, schwaarz, F-Bottom / Chimney Well, Greiner Bio-One, Kremsmünster, Éisträich) a mat Klebstoff bedeckt.LLPs goufen iwwerwaacht andeems d'Absorptioun bei 350 nm am Zentrum vun der Léisung an engem CLARIOstar Plack Lieser (BMG Labtech, Ortenberg, Däitschland) gemooss gouf.D'Experimenter goufen an triplicate bei 25 ° C duerchgefouert, an d'Feeler goufen als Standard deviation vun der Moyenne berechent.D'verdünnte Phase gouf duerch Probe Zentrifugéierung a SDS-PAGE Gel Analyse quantifizéiert, an d'αS Fraktioun an der verdënntem a konzentréierter Phase gouf a verschiddene LLPS Léisungen quantifizéiert.Eng 100 μl LLPS Probe mat 1 μM AF488-label αS gouf duerch grëndlech Vermëschung virbereet, gefollegt vun der Zentrifugéierung bei 9600 × g fir 30 Minutten, no deem de Nidderschlag normalerweis sichtbar war.Déi Top 50 μl vum Supernatant gouf fir Proteinquantifikatioun mat SDS-PAGE Gel benotzt.Gels goufen mat AF488 Filtere gescannt mat engem ChemiDoc Gel Imaging System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) oder mat Coomassie Fleck gefierft a mat passenden Filtere visualiséiert.Déi doraus resultéierend Bands sech mat ImageJ Versioun 1.53i (National Instituter vun Gesondheet, USA) analyséiert.D'Experimenter goufen an Duplikat an zwee verschidden Experimenter mat ähnlechen Resultater duerchgefouert.
Typesch, goufen 150 μl vun Echantillon op net-bindender 96-gutt microplates applizéiert a bei Raumtemperatur op engem Leica DMI6000B ëmgedréint Mikroskop visualiséiert (Leica Microsystems, Wetzlar, Däitschland).Fir Fleckexperimenter goufen µ-Slide Angiogenesis Placke (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Däitschland) oder 96-Well Polystyrol Mikroplaten (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) och benotzt.EL6000 Halogen oder Quecksilber Metallhalogenidlampen goufen als Beliichtungsquellen benotzt (fir BF / DIC a WF Imaging, respektiv).Fir WF Mikroskopie gouf e 40x Vergréisserungsobjektiv (Leica Microsystems, Däitschland) benotzt fir d'Liicht op d'Probe ze fokusséieren an ze sammelen.Fir AF488 an ThT markéiert Echantillon, Filter excitation an Emissioun mat Standard GFP Filter Sets, excitation an Emissioun Bandpass Filtere, respektiv, 460-500 nm an 512-542 nm Bandpass Filtere, an engem 495 nm dichroic Spigel.Fir Echantillon mat Atto647N Label, e Standard Set vun Cy5 Filtere mat excitation an Emissioun Bandpass Filtere 628-40 nm respektiv 692-40 nm, an engem 660 nm dichroic Spigel goufen benotzt.Fir BF an DIC Mikroskopie benotzt datselwecht reflektéiert Liichtsammlungsobjektiv.Dat gesammelt Liicht gouf op enger Leica DFC7000 CCD Kamera (Leica Microsystems, Däitschland) opgeholl.D'Beliichtungszäit war 50 MS fir BF an DIC Mikroskopie Imaging an 20-100 MS fir WF Mikroskopie Imaging.Zum Verglach war d'Beliichtungszäit fir all Experimenter mat ThT 100 ms.Time-lapse Experimenter goufen ausgefouert fir d'Drëpskoaleszenz ze visualiséieren, mat Biller déi all 100 ms fir e puer Minutten gesammelt ginn.ImageJ (NIH, USA) war fir Bild Analyse benotzt.D'Experimenter goufen an triplicate mat ähnlechen Resultater duerchgefouert.
Fir Kolokaliséierungsexperimenter, FRAP an 3D Rekonstruktioun, goufen Biller op engem Zeiss LSM 880 ëmgedréint konfokalem Mikroskop mat enger ZEN 2 bloer Editioun (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Däitschland) kaaft.Echantillon vun 50 μl goufen op µ-Slide Angiogenesis Petri Platen (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Däitschland) applizéiert, mat engem hydrophile Polymer (ibiTreat) behandelt an an engem 63 × Ueleg Immersion Objektiv montéiert (Plan-Apochromat 63 × / NA 1.4 Oil) op DIC).D'Biller goufe mat 458 nm, 488 nm a 633 nm Argon Laserlinne mat enger Opléisung vun 0,26 µm / Pixel an enger Beliichtungszäit vun 8 µs / Pixel fir Excitatiouns- an Emissiounsdetektiounsfenster vu 470–600 nm, 493–600 nm, 493–6,28 nm, 600 nm, a 638-755 nm gouf benotzt fir ThT, AF488 an Atto647N ze visualiséieren, respektiv.Fir d'FRAP Experimenter, Time-lapse Fotografie vun all Prouf gouf op 1 Frame pro Sekonn opgeholl.D'Experimenter goufen an triplicate bei Raumtemperatur mat ähnlechen Resultater duerchgefouert.All Biller goufen analyséiert mat Zen 2 Blue Editioun Software (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Däitschland).D'FRAP Kéiren goufen normaliséiert, geplot a passend op Intensitéit / Zäitdaten extrahéiert aus Biller mat Zen 2 mat OriginPro 9.1.D'Erhuelungskurven goufen op e mono-exponentielle Modell gepasst fir d'molekulare Diffusioun mat engem zousätzleche exponentielle Begrëff ze berechnen fir den Acquisitioun Bleechungseffekt ze berechnen.Mir hunn dann D berechent mat dem nominalen Bleichradius an der virdru bestëmmter Erhuelungshallefzäit wéi an der Equatioun vu Kang et al.5 35 ugewisen.
Eenzel Cystein Varianten vun αS goufen mat 4-Hydroxy-2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-N-oxyl (TEMPOL) op Positiounen 24 (TEMPOL-24-αS) an 122 (TEMPOL-122-αS) synthetiséiert, respektiv.Spin Etikettéierung Fir EPR Experimenter gouf d'αS Konzentratioun op 100 μM gesat an d'PEG Konzentratioun war 15% (w/v).Fir verschidde Aggregatiounsbedéngungen war den αS: pLK Verhältnis 1:10, während d'αS: ΔNt-Tau an αS: Tau441 Verhältnisser bei 1:1 gehale goufen.Fir bindend Titratiounsexperimenter an der Verontreiung vun der Iwwerraschung, gouf TEMPOL-122-αS bei 50 μM behalen a Polykatioune goufe bei erhéijen Konzentratioune titréiert, all Konditioun separat virbereet.CW-EPR Miessunge goufen mat engem Bruker ELEXSYS E580 X-Band Spektrometer ausgestatt mat engem Bruker ER4118 SPT-N1 Resonator, deen op enger Mikrowelle (SHF) Frequenz vun ~9,7 GHz funktionnéiert.D'Temperatur gouf op 25 ° C gesat a kontrolléiert vun engem flëssege Stickstoffkryostat.D'Spektra goufen ënner onsaturéierte Bedéngungen bei enger MW Kraaft vu 4 mW, enger Modulatiounsamplitude vun 0,1 mT an enger Modulatiounsfrequenz vun 100 kHz kritt.Spektralintensitéite goufen normaliséiert fir Differenzen an Spinkonzentratioune tëscht Proben a méiglecher Spinreduktioun ze vermeiden wéinst Reschtkonzentratioune vu Reduzéierungsmëttelen a Proben déi Tau441 oder ΔNt-Tau enthalen (präsent an den originelle Proteinléisungen).Déi gegebene Wäerter vu g goufen als Resultat vun der EPR Spektralmodelléierung kritt mat der Easyspin Software (v. 6.0.0-dev.34) implementéiert an Matlab®67.Een / zwee Komponent isotropesch Modeller goufen benotzt fir d'Donnéeën ze modelléieren.No der Normaliséierung vun all Signaler, goufen d'Residualen berechent andeems all Simulatioun aus dem entspriechende experimentelle Spektrum subtrahéiert gouf.Fir bindend Titratiounsanalyse gouf d'relativ Intensitéit vun der drëtter Band zu der zweeter Band vum normaliséierte EPR Spektrum (IIII /III) benotzt fir d'Bindung vu Polykationen op αS ze iwwerwaachen.Fir d'Dissoziatiounskonstant (Kd) ze schätzen, gouf déi doraus resultéierend Kurve op e geschätzte Modell ugepasst, deen n identesch an onofhängeg Bindungsplazen ugeholl huet.
NMR Spektroskopie Experimenter goufen mat engem Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR Spektrometer ausgestatt mat enger Kryoprobe an Z-Gradient duerchgefouert.All Experimenter goufen mat 130-207 µM αS an entspriechend αS /ΔNt-Tau a pLK Äquivalenten an 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 gemaach a goufen bei 15 ° C gemaach.Fir LPS duerch NMR ze iwwerwaachen, gouf 10% PEG zu de pre-gemëschte Proben bäigefüügt.D'chemesch Verréckelung perturbation Komplott (Figebam. 1b) weist der Moyenne 1H an 15N chemesche Verréckelung.D'αS 2D1H-15N HSQC Spektre goufen op Basis vun enger viregter Aufgab (BMRB Entrée #25227) zougewisen a bestätegt andeems d'3D Spektra vun HNCA, HNCO an CBCAcoNH opgeholl an analyséiert goufen.13Cα an 13Cβ chemesch Verréckelung goufen a Präsenz vun ΔNt-Tau oder pLK berechent fir méiglech Ännerungen an de sekundäre Strukturtrends ze moossen am Verglach mat αS chemesche Verréckelungen an der purer zoufälleger Spiralkonformatioun 68 (Ergänzungsbild 5c).D'R1ρ Tariffer goufen gemooss andeems hsqctretf3gpsi Experimenter opgeholl ginn (vun der Bruker Bibliothéik kritt) mat Verzögerungen vun 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 an 800 ms, an d'exponentiell Funktiounen goufen op d'Spëtzintensitéit ugepasst. Zäit fir de R1ρ a seng experimentell Onsécherheet ze bestëmmen.
Zwee-Faarf Zäit-geléist Fluoreszenz Mikroskopie Experimenter goufen op engem kommerziellen Zäit-geléist MT200 Fluoreszenz konfokal Mikroskop (PicoQuant, Berlin, Däitschland) mat engem Zäit-korreléiert Single Photon zielen (TCSPC) Apparat gesuergt.De Laserdiodekop gëtt fir pulséiert interleaved excitation (PIE) benotzt, de Strahl passéiert duerch e Single-Modus Welleguide a gëtt op eng Laserkraaft vun 10 bis 100 nW fir 481 nm an 637 nm Laserlinne gemooss no engem dichroesche Spigel ofgestëmmt.Dëst garantéiert en optimalen Photonzielungsquote, vermeit d'Effekter vum Photonaliasing, Photobleechung a Sättigung.μ-Slide Angiogenesis Coverslips oder Placke (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Däitschland) goufen direkt an Tauchwasser iwwer e Super Apochromat 60x NA 1.2 Lens mat engem Korrekturkraaft gesat (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).E 488/640 nm dichroesche Spigel (Semrock, Lake Forest, IL, USA) gouf als Haaptstrahlsplitter benotzt.Onfokusséiert Stralung gëtt duerch e Lach mat engem Duerchmiesser vu 50 Mikron blockéiert, duerno gëtt déi fokusséiert Stralung duerch e 50/50 Strahlensplitter an 2 Detektiounsweeër opgedeelt.Bandpass Emissioun Filtere (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 fir gréng Faarf (AF488) an 690/70 fir rout Faarftéin (Atto647N) virun der detektéieren benotzt.Single-photon lawine diodes (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italien) goufen als Detektoren benotzt.Béid Datensammlung an Analyse goufen mat der kommerziell verfügbarer SymphoTime64 Software (PicoQuant GmbH, Berlin, Däitschland) gesuergt.
Fofzeg Mikroliter vun LLPS Echantillon goufen op μ-Slide angiogenesis Wells applizéiert (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Däitschland).Déi doraus resultéierend Biller sinn op 20 µm iwwer de Well ënnen fokusséiert fir optimal objektiv Aarbechtsdistanz fir suspendéiert Drëpsen an ~ 1 µm fir Flotten a Punkte mat enger axial Resolutioun vun op d'mannst 0.25 µm / Pixel an enger Verzögerung Zäit vun 400 µs / Pixel.Wielt Donnéeën andeems Dir eng Intensitéitschwell ugewannt baséiert op der duerchschnëttlecher Hannergrondsignalintensitéit (PBG, mëttler + 2σ) fir all Kanal, sou datt nëmme flësseg Proteindrëpsen, Flotten oder Flecken ausgewielt ginn, all méiglech Hierkonft aus der verspreeter Phase filtert.Fir d'Liewensdauer vun all Spezies (τ) vun all Kanal ze analyséieren (gréng, "g" fir AF488 a rout, "r" fir Atto647N), hu mir Regiounen vun Interessi (ROIs) ausgewielt mat Drëpsen, Flotten oder Flecken (Ergänzungsbild 1) ).8b) an ofgeleet se andeems se hir Liewensdauer Zerfall passen (τD, τR an τP fir Drëpsen, Flotten oder Flecken, respektiv, kuckt Ergänzungsfig. 8c) an all Kanal mat enger Schwanz-Fit-Analyse an engem Zwee-Komponenten Zerfallmodell.Duerchschnëtt τ vun τ.ROIs déi ze wéineg Photonen produzéiert hunn fir eng multi-exponentiell Passung goufen aus der Analyse ausgeschloss.De benotzte Cutoff war <104 Photonen fir Flotten a Punkten an 103 fir Drëpsen.D'Drëpsen hunn eng méi niddereg Schwell, well et schwéier ass Zerfallkurven mat méi héijen Intensitéitswäerter ze kréien, well d'Drëpsen am Bildfeld normalerweis méi kleng a manner vill sinn.ROIs mat Photonzuelen iwwer d'Photonakkumulatiounslimit (op >500 Konte / Pixel gesat) goufen och fir Analyse verworf.Match d'Intensitéit Zerfall Curve kritt aus der Regioun vun Interessi mat enger Intensitéit op 90% vum Maximum (liicht no der maximal Intensitéit vum Zerfall) vum Ufank vum Service Liewen ze garantéieren minimal IRF Interferenz iwwerdeems déi selwecht fir all Intensitéit Zerfall behalen Astellunge Relativ Zäit Fënster goufen analyséiert 25 ze 50 ROI fir flotten a Flecken an 15-25 ROI fir Drëpsen, Biller ausgewielt aus méi wéi 4 replizéiert opgeholl aus op d'mannst 3 onofhängeg Experimenter.Zwee-tailed T-Tester goufen benotzt fir statistesch Differenzen tëscht Arten oder tëscht Koacervate Systemer ze evaluéieren.Fir eng Pixel-vun-Pixel Analyse vun der Liewensdauer (τ), gouf d'total Dämpfung vun der Liewensdauer iwwer d'Feld fir all Kanal berechent an eng Approximatioun vun engem 2/3-Komponente exponentielle Dämpfungsmodell gouf duerchgefouert.D'Liewensdauer Dämpfung fir all Pixel gouf duerno mat virdru berechent τ Wäerter ugepasst, wat zu engem Pseudocolor FLIM Fit Bild resultéiert.De Schwanz-Fit Liewensdauerbereich war d'selwecht iwwer all Biller vum selwechte Kanal, an all Zerfall huet genuch Photonen produzéiert fir en zouverléissege Fit ze bidden.Fir FRET Analyse goufen Pixel ausgewielt andeems se e méi nidderegen Intensitéitschwell vun 100 Photonen applizéiert hunn, wat en Hannergrondsignal (FBG) vun 11 Photonen duerchschnëtt.D'Fluoreszenzintensitéit vun all Kanal gouf duerch experimentell bestëmmte Korrekturfaktoren korrigéiert: 69 Spektral Iwwerschwemmung α war 0,004, direkt excitation β war 0,0305, Detektiounseffizienz γ war 0,517.D'FRET Effizienz um Pixelniveau gëtt dann mat der folgender Equatioun berechent:
wou FDD d'Fluoreszenzintensitéit ass, déi am Donor (gréngen) Kanal observéiert gëtt, ass FDA d'Fluoreszenzintensitéit, déi am Akzeptor (rout) Kanal ënner indirekter Excitatioun observéiert gëtt, an FAA ass d'Fluoreszenzintensitéit, déi am Akzeptor (rout) Kanal ënner direkter Excitatioun observéiert gëtt ( PIE).Fluoreszenz Intensitéit Impulser ginn am Kanal beobachtet).
Plaz 100 μl vun LLPS Reaktiounsléisungen mat 25 μM unlabeled monomere Tau441 (mat oder ouni 25 μM αS) an LLPS Puffer (ergänzen wéi uewendriwwer) op net-bindende 96-Well Mikroplacke mat Klebstofffoliebeschichtung an Drëpsbildung gouf duerch WF Mikroskopie gepréift. Equilibratioun.innerhalb 10 min.No 48 Stonnen Inkubatioun bei Raumtemperatur gouf d'Präsenz vu Proteinflotten a Flecken bestätegt.Dann suergfälteg d'Flëssegkeet iwwer d'Flotte aus de Brunnen erofhuelen, dann 50 L Dissoziatiounsbuffer (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) addéieren an 10 min inkubéieren.Déi héich Salzkonzentratioun garantéiert datt LLPS net widderhuelen wéinst Rescht PEG, a méiglech Proteinversammlungen, déi nëmmen duerch elektrostatesch Interaktiounen geformt ginn, ginn ofgebaut.De Buedem vun der Brunn gouf duerno suergfälteg mat engem Mikropipette Tipp ofgeschrauft an déi entstinn Léisung gouf an eng eidel Observatiounsbrunn transferéiert.No der Inkubatioun vun de Proben mat 50 μM ThT fir 1 h, gouf d'Präsenz vun isoléierte Flecken duerch WF Mikroskopie gepréift.Bereet sonicated αS Fibrillen duerch Inkubatioun vun 300 μl vun enger 70-μM αS Léisung am PBS mat pH 7.4, Natriumazid 0,01% bei 37 ° C an 200 rpm op engem Orbital Shaker fir 7 Deeg.D'Léisung gouf duerno bei 9600 × g fir 30 min centrifugéiert, de Pellet gouf am PBS pH 7,4 resuspendéiert an sonicated (1 min, 50% Zyklus, 80% Amplitude an engem Vibra-Cell VC130 Sonicator, Sonics, Newton, USA) Fibril Echantillon mat enger relativ eenheetlecher Gréisst Verdeelung vu klenge Fibrillen.
FCS /FCCS Analyse an zwee-Faarf Zoufall Detektioun (TCCD) goufen op der selwechter MT200 Zäit-opléisen fluorescent confocal Mikroskop (Pico-Quant, Berlin, Däitschland) fir d'FLIM-FRET Mikroskopie Experimenter benotzt de PIE Modus benotzt.D'Laserkraaft fir dës Experimenter gouf op 6.0 µW (481 nm) a 6.2 µW (637 nm) bäigefüügt.D'Kombinatioun vun dëse Laser-Kraaft gouf gewielt fir ähnlech Hellegkeet fir d'Paire vu Fluoroforen ze produzéieren, wärend optimal Zählungsraten erreechen an Photobleechung a Sättigung vermeiden.Béid Datensammlung an Analyse goufen mat der kommerziell verfügbarer SymphoTime64 Versioun 2.3 Software (PicoQuant, Berlin, Däitschland) gesuergt.
Echantillon vun isoléierten αS /Tau Aggregaten, déi mat LLPS kritt goufen, ginn an Isolatiounsbuffer op déi entspriechend monomolekulär Konzentratioun verdünnt (typesch eng 1:500 Verdünnung, well d'Aggregate scho bei niddrege Konzentratioune si wann se aus Koacervatproben isoléiert sinn).Echantillon goufen direkt op Coverslips applizéiert (Corning, USA) precoated mat enger BSA Léisung bei enger Konzentratioun vun 1 mg /ml.
Fir d'PIE-smFRET Analyse an de gréngen a roude Kanäl gouf e méi nidderegen Intensitéitschwell vu 25 Photonen applizéiert fir niddereg Intensitéit Signaler ze filteren, déi duerch monomer Eventer verursaacht ginn (Notiz datt d'Monomeren méi wéi aggregéiert Echantillon am Verglach mat isoléierten Aggregaten iwwerschreiden).Dëse Schwell gouf berechent wéi fënnef Mol d'Duerchschnëttsintensitéit vum monomere αS, deen aus der Analyse vu pure Monomer Echantillon kritt gouf, fir spezifesch Aggregater fir Analyse ze wielen.De PIE Drive Circuit, zesumme mat der TSCPC Dateacquisitioun, huet d'Applikatioun vun engem Liewensdauergewiichtfilter aktivéiert, deen hëlleft den Hannergrond a Spektral Crosstalk ze eliminéieren.D'Flare Intensitéit ausgewielt mat den uewe genannte Schwellen gouf korrigéiert mat dem duerchschnëttleche Hannergrondsignal aus den Histogramme vum Optriede versus Intensitéit / Bin vun de Puffer-nëmmen Echantillon.Bursts verbonne mat groussen Aggregaten besetzen typesch e puer opfolgend Poubellen an der Zäitspur (op 1 ms festgeluecht).An dëse Fäll gouf e Bin vu maximaler Kraaft gewielt.Fir FRET a stoichiometresch Analyse gouf den theoretesch bestëmmte Gammafaktor γ (0,517) benotzt.Spektral Crosstalk an direkt excitation Contributiounen sinn negligible (experimentell bestëmmt) op der excitation Laser Muecht benotzt.D'Effizienz an d'Stöchiometrie vu FRET an enger Explosioun gëtt berechent wéi follegt.