347 STAINLESS Stol coiled tubing chemesch Komponent, Identifikatioun vun neien interferon-reaktiounsfäeger mënschlech Leukozyten Antigen-A (HLA-A) Chaperone Proteinen mat cross-linked Mass Spektrometrie (CLMS)

Merci fir besicht Nature.com.Dir benotzt eng Browser Versioun mat limitéierter CSS Ënnerstëtzung.Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten).Zousätzlech, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, weisen mir de Site ouni Stiler a JavaScript.
Sliders déi dräi Artikelen pro Rutsch weisen.Benotzt d'Réck- an d'nächst Knäppercher fir duerch d'Rutschen ze réckelen, oder d'Slide Controller Knäppercher um Enn fir duerch all Rutsch ze réckelen.

Produkt beschreiwung

Edelstol 347L Coil Tubes, Stol Grad: SS347L

Den Interferon-Signalsystem induzéiert eng staark Zytokin-Äntwert op eng breet Palette vu pathogenen an intrinsesche pathologesche Signaler aus der Ëmwelt, wat zu der Induktioun vun Ënnersätz vun interferon-induzéierbaren Proteinen resultéiert.Mir hunn DSS-mediéiert Cross-Link Mass Spektrometrie (CLMS) applizéiert fir nei Protein-Protein Interaktiounen am Domain vun interferon-induzéierte Proteinen z'entdecken.Zousätzlech zu den erwaarten interferon-induzéierbare Proteinen, hu mir och nei intermolekulär an intramolekulär vernetzt Addukte vu kanoneschen interferon-induzéierbare Proteine ​​​​wéi MX1, USP18, OAS3, an STAT1 identifizéiert.Mir konzentréieren eis op orthogonal Validatioun vun engem Roman Set vun interferon-induzéierbar Protein Netzwierker geformt vun HLA-A Proteinen (H2BFS-HLA-A-HMGA1) mat Co-Immunoprecipitatioun an hir weider Studie mat molekulare Dynamik Modeller.Modelléierung vun der konformationaler Dynamik vum Proteinkomplex huet verschidde Interaktiounsplazen opgedeckt, déi d'Interaktiounen reflektéiert, déi an de CLMS Erkenntnisser identifizéiert goufen.Zesumme presentéiere mir eng Pilotstudie vu CLMS fir nei Signalkomplexer ze identifizéieren, déi duerch Interferon induzéiert sinn, a freeën eis op déi breet Notzung vu CLMS fir nei Dynamik vu Proteininteraktiounen am Tumormikro-Ëmfeld z'identifizéieren.
Ier eng adaptiv Immunantwort ufänkt, montéiert dem Host säin gebiertege Verteidegungssystem eng antimikrobial Äntwert vermëttelt duerch eng Famill vu secretéierten alpha-helical Zytokine genannt Interferonen (IFNs).D'Typ I IFN Klassen IFNα an IFNβ aktivéieren cellulär Äntwerten, dorënner antiviral, proapoptotesch, proinflammatoresch an antiproliferativ Staaten.Bei Mënschen sinn 13 Ënnertypen vun IFNα bekannt, all op Chromosom 91 geclustert. Iwwerraschend ass nëmmen IFNα2 fir klinesch Benotzung studéiert.Viru kuerzem ass speziell Opmierksamkeet fir Fuerschung iwwer aner Ënnertypen vun IFNα bezuelt ginn.Eng rezent Studie huet gewisen datt IFNα14 eng vun den effektivsten Isoformen ass fir HBV2 an HIV-13,4 Replikatioun ze beschränken am Verglach zum kanonesche IFNα2 Subtyp.
Et gouf festgestallt datt aktivéiert Typ I Interferon Rezeptor Komplexe (IFNAR1 an IFNAR2) eng Signaltransduktiounskaskade ausléisen, déi duerch Janus-Kinasen TYK2 a JAK15,6 vermëttelt gëtt.Dës Janus-Kinasen phosphorylat Signaltransducer an Transkriptiounsproteinaktivatoren (STAT1 a STAT2) op Tyrosinreschter fir SH2 Domain-mediéiert Heterodimeriséierung6 ze initiéieren.Duerno bindt IRF9 STAT Heterodimeren fir en trimeresche Komplex vum IFN-stimuléierte Faktor 3 Gen (ISGF3) ze bilden, deen an de Kär translokéiert an d'Transkriptioun vun iwwer 2000 interferon-stimuléiert Genen (ISGs) 5,6,7,8 induzéiert.
ISGs bilden de Pilier vum gebuerene Immunsystem, besonnesch als Äntwert op viral Attack.Als éischt Linn vun der Verteidegung géint viral Infektioun setzen d'Zellen séier extensiv Interaktioune vu celluläre Proteinen mat enger breet Palette vu biologeschen Aktivitéiten aus.Dës Proteine ​​enthalen Mustererkennungsrezeptoren, Signalmoleküle, Transkriptiounsfaktoren a Proteine ​​​​mat direkten antivirale Funktiounen, souwéi negativ Reguléierer vun Immunreaktiounen9.Vill vun der Informatioun iwwer ISG Aktivitéit kënnt vu funktionnelle Schiirme mat Iwwerexpressiounsschirmer10,11 oder Gen Silencing Techniken (siRNA, RNAi a CRISPR)12,13, an deenen eenzel ISGs ausgedréckt oder hemmt ginn an hir Aktivitéit op verschidde Viren getest gëtt.Och wann dës Studien d'antiviral Eegeschafte vun eenzelne ISGs bestëmmt hunn, bleiwen déi ënnerierdesch molekulare Mechanismen vun all ISG gréisstendeels onbekannt.Et ass allgemeng akzeptéiert datt vill Proteine ​​​​mat engem oder méi Zytokine interagéieren fir voll Aktivitéit ze garantéieren, also entweder ISGs interagéieren direkt oder hir Interaktioune ginn duerch cellulär Proteine ​​​​mediéiert.Zum Beispill, eng rezent photocrosslinked proteomics Etude identifizéiert ATPase VCP / p97 als grouss IFITM3 Interaktioun Partner, deem seng Inhibitioun féiert zu Mängel an lysosomal Sortéierung, Ëmsaz, an cotransport vun IFITM3 mat viral Partikel 14.Mat Hëllef vun Immunoprecipitatioun hu mir VAPA identifizéiert, e Vesikel-assoziéiert Protein, als Interaktiounspartner mat IFITM1/2/3, deen Cholesterin-mediéiert viral Reifung vermëttelt, an dëst gouf vun enger anerer Studie bestätegt mat engem Hef zwee-Hybrid System.Wëssenschaftlech Ënnerstëtzung 15, 16.
E fundamentale biologesche Prozess, deen an der Ënnerdréckung vun der Infektioun a béiswëlleger Transformatioun involvéiert ass, ass Antigenpresentatioun, déi duerch grouss Histokompatibilitéitskomplex (MHC) Molekülle vermëttelt gëtt.Peptiden (8-12 Aminosaier Saieren laang) aus gesplécktem, virzäiteg ofgeschloss oder misfolded Proteinen sinn an der MHC-I Heterodimer gelueden (besteet aus MHC-I schwéier a liicht Ketten, genannt β-2-Mikroglobulin; β2M) 17,18.Déi resultéierend stabil MHC-I Trimere ginn op d'Zelloberfläche transportéiert, wou se intrazellulär Peptiden un CD8+ T Zellen (cytotoxesch T Zellen)17 presentéieren.T Zellen erkennen an zerstéieren dës Pathogenen an Zellen, déi en tumorspezifesche Antigen droen.Dofir ënnerdrécken Pathogenen an Tumorzellen dacks den Antigen Presentatiounsprozess fir Immuniwwerwaachung ze vermeiden.Zousätzlech ass MHC-I an 40-90% vu mënschlechen Tumoren downreguléiert an ass dacks mat enger méi schlechter Prognose verbonnen19.
Genen, déi an der Äntwert op Pathogenen involvéiert sinn, musse séier tëscht engem Zoustand vun der Rou an engem Zoustand vun der aktiver Transkriptioun wiesselen.Dofir gi verschidde cellulär Proteine ​​​​hypotheséiert fir an der Äntwert op eng héich IFN Nofro iwwer kuerz Zäitperioden involvéiert ze sinn, dorënner d'Remodeling an d'Modifikatioun vum Promoteur Chromatin 20,21.Déi meescht Studien hu sech op d'Identifikatioun vun eenzelne ISG Proteinpartner an der Präsenz vun IFN konzentréiert.Verschidde proteomesch an transkriptomesch Studien a Modellzellsystemer hunn den Effekt vum IFN op der cellulärer Landschaft opgekläert.Wéi och ëmmer, trotz engem wuessende Verständnis vun der Dynamik, déi duerch Interferonen induzéiert gëtt, wësse mir nach ëmmer wéineg iwwer d'Bedeelegung vun ISGs.Wann Dir d'Komplexitéit an d'Zäit-ofhängeg Dynamik vun der Interferon-Signaliséierung berücksichtegt, stelle sech zwou Froen op: (i) ass et méiglech d'Multiprotein-Komplexe ze stabiliséieren an ze falen, déi a séier Signaliséierung involvéiert sinn, an (ii) kënnen dës Interaktiounen an 3D Raum kartéiert ginn?
Fir dës Themen unzegoen, hu mir disuccinimid suberate-mediéiert chemesch Cross-linking (DSS) mat Massespektrometrie (CLMS) gekoppelt fir den IFNα-induzéierte Protein Interaktiounsnetz a seng Dynamik ze studéieren.DSS füügt kovalente Bindungen tëscht proximale Reschter vu Proteinen an / oder Proteinkomplexe in vivo.Déi spéider MS Analyse weist spezifesch Crosslinking Sites op, déi d'raimlech Proximitéit vu Regiounen an engem bestëmmte Protein reflektéieren, intern Verknüpfungen genannt, oder Ënnerunitéiten a Proteinkomplexen, genannt Interrelatioune.Mat dëser Approche hu mir e puer nei Protein-Protein-Komplexe identifizéiert wéi och interferon-induzéiert Multiprotein Interaktiounsnetzwierker.Andeems Dir en Ënnerdeel vun dësen neien Interaktiounen weider testen, beweise mir datt H2BFS (H2B Histon-Typ FS; heino H2B bezeechent) an MDN1 als bindend Partner fir HLA-A handelen.
Flo-1 Zellen sinn ee vun de bekanntste in vitro Modeller vun esophageal adenocarcinoma well se Schlëssel Fonctiounen vun esophageal erhéijen mimic22,23.Wéi och ëmmer, net all Tumoren sinn immunogen, a fir ze bestëmmen ob Flo-1 Zellen op d'Interferonbehandlung reagéieren, hu mir Flo-1 Zellen mat 10 ng /ml IFNα fir 72 Stonnen behandelt.Flo-1 Zellen hunn fréi Induktioun vu pSTAT1 an IRF1 gewisen, ugefaang 2 Stonnen no der Behandlung a weider fir 72 Stonnen, mat enger Zäit-ofhängeger Ofsenkung vun stationären Niveauen vun IRF1 (Dorënner 1A).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1 / 2, an ISG15) goufen no 6 Stonnen staark induzéiert fonnt, déi klassesch Mëttel- a spéide Phase Äntwerten op IFNα (Dorënner 1A) mimikéieren.Zesummen suggeréieren dës Donnéeën datt dësen celluläre Modell ka benotzt ginn fir Interferonreaktiounen ze studéieren.
Differenziell Protein Ausdrock Äntwerten an Flo-1 Zellen no IFNα Behandlung.(A) Protein Ausdrock an Flo-1 Zellen behandelt mat 10 ng /ml IFNα fir 2, 6, 24, 48 an 72 Stonnen war vun immunoblot analyséiert mat der uginn ISG antibodies.(B) Coomassie blo gefärbte SDS-PAGE Gele vu ganz Zellextrakter nom Cross-linking mat DSS fir uginn Zäiten a Konzentratioune.(C) Vertrieder Immunoblot iwwerpréift mat p53 (DO-1) Antikörper aus de selwechte Proben fir de Grad vun der Proteinverbindung ze bewäerten.
Fir d'in situ Protein Interaktiounslandschaft z'erfaassen, hu mir DSS benotzt, e wäit benotzte Cross-linking Agent wéinst senger héijer Membranpermeabilitéit a relativ kuerzer Reaktiounszäit.Déi méi kuerz Reaktiounszäit hëlleft d'Bildung vu grousse Aggregate vu vernetzten Proteinen ze vermeiden, an doduerch d'Stabilitéit vum Crosslinker behalen.Fir déi optimal DSS Konzentratioun ze bestëmmen an iwwer-crosslinking ze vermeiden, hu mir als éischt d'Zellen op 5, 2,5 an 1 mM DSS fir 5, 10, 5 an 30 Minutten ausgesat, respektiv, an analyséiert d'Lysate vun Coomassie-gefärbte SDS-PAGE (Donnéeën net gewisen).Zelllysate schéngen héich vernetzt ze sinn an der niddregster Konzentratioun an am kuerste Zäitpunkt.Dofir gouf DSS op 1, 0,5 an 0,1 mM iwwer 5 Minutten titréiert (Dorënner 1B).Optimal Crosslinking gouf mat 0,5 mM DSS fir 5 Minutten observéiert, an dës Konditioune goufen fir Zellen gewielt, déi mat IFNα behandelt goufen.Zousätzlech weist Figur 1C e Western Blot mat der p53 (DO-1) Antikörper gesuergt fir de Grad vun der Proteinverbindung ze bewäerten.
Flo-1 Zellen goufen mat 10 ng /ml IFNα fir 24 Stonnen behandelt ier de Crosslinker bäigefüügt gouf.Cross-linked Zellen goufen duerno vun zwee-Schrëtt proteolysis lysed a Proteinen sech duerch FASP veraarbecht (Fig. 2) 24,25.Kräiz-verbonne tryptic peptides sech duerch Mass spectrometry (Lalumi 2) analyséiert.D'MS / MS Spektre ginn dann un d'Protein Sequenz ugepasst a mat MaxQuant26,27 quantifizéiert.Cross-linked Peptiden goufen aus de kritt Spektrum mam SIM-XL Programm identifizéiert, an eenzel Verbindungen goufen an e komplexe Netzwierk kombinéiert mat den xQuest28 an SIM-XL29 Open Source Computing Software Pipelines (Fig. 2).SIM-XL identifizéiert Protein-Protein Interaktiounen, intern Ketten an eenzel Ketten an einfachen oder komplexe Proteinmëschungen a bitt Scripte fir d'Visualiséierung vun Interaktiounen an Proteinstrukturen.Zousätzlech rangéiert et all Kräizreferenz als ID Score no der MS / MS29 Spektrumqualitéit.Verschidde héich zouverlässeg Protein-Protein Interaktiounen a Komplexe goufen identifizéiert, an eng nei Rei vun Interaktiounen gouf weider ënnersicht mat Hëllef vu Co-Immunoprecipitatioun a konformational Verännerunge vu Komplexe mat der molekulare Dynamik (MD) Modelléierung (Fig. 2) 30, 31.
Schematesch Iwwersiicht vun der CLMS Method.Flo-1 Zellen goufen mat 10 ng /ml IFNα fir 24 Stonnen behandelt gefollegt vun in situ Protein Kräiz-Verbindung mat DSS gefollegt vun Zell lysis an trypsinization.Cross-linked Echantillon goufen analyséiert mat engem Orbitrap Mass Spektrometer a weider Echantillon fir Fragmentatioun vun Peptid Virleefer während LC-MS /MS.Zwee verlinkte Peptiden goufen aus de kritt Spektrum identifizéiert mat der Spectrum Recognition Machine vum Crosslinked Peptides (SIM-XL) Programm, an all Verbindunge goufen an e komplext Netzwierk mat computational Pipelines kombinéiert.Filtert niddereg Vertrauensinteraktiounen baséiert op falschen Positiven Taux (FDR) Scores.Verschidde nei High-Fidelity Protein-Protein Interaktiounen goufen weider mat Co-Immunoprecipitatioun bestätegt, a konformational Verännerungen an de Komplexe goufen iwwerpréift mat der molekulare Dynamik (MD) Modelléierung.
A Ganzen ~ 30.500 an ~ 28.500 peptides sech mat MaxQuant an unstimulated an stimuléiert IFNα Echantillon festgestallte, respektiv (Ergänzungstabell S1, Lalumi 3A).D'Peptid Längt Verdeelung a béide Fäll huet e méi héijen Undeel vu gréissere Peptiden gewisen, wat d'Präsenz vu vernetzten Peptiden (Lalumi 3B, C) beweist.Zousätzlech, waren e groussen Undeel vun gréisser peptides am 40-55 Gamme präsent an IFNα-behandelt Echantillon (Lalumi 3C).Protein Mapping géint log2 Intensitéit huet gewisen datt klassesch interferon-stimuléiert Proteinen am meeschte reichend waren am Verglach mat onbehandelt Proben, dorënner MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, an HLA-F (Dorënner 3D).Analyse vu Weeër fir Proteine ​​​​méi wéi dräifach beräichert an Äntwert op IFNα Behandlung mat der Reactome Passerelle Datebank huet gewisen datt MHC-I-mediéiert Antigen Presentatioun a Veraarbechtung de dominante Wee war (Dorënner 3E).Konsequent mat fréiere Berichter, antiviral Äntwerte vermëttelt vun OAS an ISG15 souwéi IFNα / β an Zytokin Signaliséierung waren zu de Weeër aktivéiert.Zousätzlech goufen Lysin- a Serin-spezifesch Protein-Kräizverbindunge vun den ursprénglechen MS /MS Spektra mat SIM-XL identifizéiert.Eng rezent Etude bericht 104 ISGs iwwer 20 Virussen aus 9 Virusklassen duerch Metaanalyse vun eenzelne ISG Iwwerexpressiounsstudien a 5 Zelltypen9.Wéi och ëmmer, fir d'Rechnerbeschränkungen vum Duerchmusterung vu groussen Datesätz ze iwwerwannen, hu mir mat engem méi klengen Datesaz ugefaang fir méiglech Interaktiounen tëscht der Lëscht vun den IRDS Genen ze entdecken, déi vum Padaria et al. gemellt goufen, déi meescht vun deenen ISGs sinn.
Identifikatioun vun differentiell ausgedréckte vernetzten Proteinen als Äntwert op IFNα (Daten kritt vum MaxQuant).(A) Venn Diagramm representéiert d'Zuel vun gemeinsamen an exklusiven Peptiden identifizéiert an IFNα14 behandelt an onbehandelt Flo-1 Proben.Peptid Längt Verdeelung vun onbehandelt (B) an IFNα behandelt (C) vernetzt Echantillon.(D) Hëtzt Kaart representéiert log2 (LFQ Intensitéit) tëscht onbehandelt an IFNα14 behandelt Flo-1 Zellen.Déi lénks Panel weist d'Proteine ​​am meeschten aktiv a Präsenz vun IFNα aktivéiert.(E) Histogram representéiert déi 20 grouss Beräicherungsweeër no der IFNα Behandlung.D'Reactome Wee Datebank analyséiert méi wéi véierfach Ännerungen an upreguléierten IFNα-reaktiounsfäeger Proteinen.
Interferon-mediéiert ISG Stimulatioun ass gutt dokumentéiert, awer um molekulare Niveau ass et schlecht verstanen wéi dës Proteinen an eng breet Palette vu biologesche Funktiounen kulminéieren.Mir ënnersicht Protein Interaktiounen mat engem héije Grad vu Vertrauen tëscht bekannten ISGs.Interessanterweis identifizéiert mir en Netz mat abegraff MX1, USP18, ROBO1, OAS3, a STAT1 Proteinen déi e grousse Komplex bilden als Äntwert op d'IFNα Behandlung (Dorënner 4, Table S2) 32,33,34.Virun allem sinn dës Interaktiounen an all Triplikater fonnt, déi mat IFNα behandelt goufen a goufen net an onbehandelt Proben fonnt, wat suggeréiert datt se speziell als Äntwert op d'IFNα Behandlung geformt goufen.Et ass bekannt datt STAT1 transkriptional den Ausdrock vun dësen ISGs reguléiert, awer seng Interaktioun mat ISGs um Proteinniveau ass net studéiert ginn.D'Kristallstruktur vu STAT1 huet gewisen datt säin helical Domain (CCD) net an der Interaktioun mat DNA oder Protomeren während der Bildung vun Dimer35 involvéiert ass.Dës α-Helice bilden eng spiralesch Helixstruktur déi eng haaptsächlech hydrophil Uewerfläch bitt fir Interaktiounen 35 opzekommen.An eise CLMS Daten hu mir observéiert datt déi meescht vun den Interaktioune mat STAT1 am SH2 Domain virum CCD, dem Linker Domain oder dem C-terminal Schwanz (Reschter 700-708) (Dorënner 4A) geschitt ass.Eng fréier Etude huet gemellt datt USP18 un d'CCD an d'DNA-bindend Domain (DBD) vun STAT2 bindt an an d'Ënnerunitéit vum Typ I Interferon Rezeptor IFNAR2 rekrutéiert gëtt fir d'Inhibitioun vum Typ I Interferon Signaliséierung 24 ze mediéieren.Eis Donnéeën hunn och gewisen datt d'USP18 katalytesch Domain mat STAT1 DBD interagéiert (Dorënner 4A, D), suggeréiert datt béid STAT1 an STAT2 eng Roll spillen an der Uzéiung vun USP18 op IFNAR2.
Protein-Protein ISG Netzwierk identifizéiert a vernetzten Zellen behandelt mat IFNα.(A) 2D Interaktiounsplot weist Protein-Protein Interaktiounen (generéiert am SIM-XL Programm), mat Linnen déi intermolekulär Interaktiounen representéieren (Kräizverbindungsschnëtt op 3,5 gesat).Domains vu verschiddenen Identitéiten sinn duerch hir Faarf32 markéiert: MX1 Domain, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), a GED (569–660).OAS3 Domainen: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), an OAS1_C (903-108).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) an fn3 (777–864).STAT1 Felder: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), an STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Kreesfërmeg Betrachter vu vernetzten Proteinen (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, a STAT1) mat Interaktiounen an Interaktiounen, respektiv a blo a rout markéiert.De Cross-Link Schwell gouf op 3,5 gesat.Dot Diagrammer weisen STAT1 Interaktiounsplaze mat MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), an OAS3 (F), souwéi K oder S Interaktiounsplazen tëscht den zwee Peptiden.An der Figur ass de Cross-Link Score-Schwell op 3.0 gesat.(G) Verschidde Interaktiounsplazen tëscht STAT1 an OAS3 DI Domainen iwwerlagert op hir Proteinstrukturen am PyMol (PyMOL molekulare Grafiksystem, Versioun 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb ID: 1bf533) an OAS3 (pdb ID: 4s3n34).) Programm.
Zwou Isoformen vun USP18 goufen am Mënsch beschriwwen, e Volllängtprotein dat haaptsächlech am Kär läit, an eng Isoform ouni N-terminal Domain, USP18-sf, déi gläichméisseg am Zytoplasma a Kär 36 verdeelt ass.Zousätzlech gouf den N-Terminus virausgesot onstrukturéiert ze sinn an erfuerdert keng Isopeptidase Aktivitéit oder ISG1537 bindend.Déi meescht vun den Interaktiounen, déi an eiser Etude identifizéiert goufen, waren um N-Terminus vum Protein lokaliséiert, wat suggeréiert datt dës Interaktiounen voll Längt USP18 (Dorënner 4A, D) involvéieren an also wahrscheinlech am Kär geschéien.Ausserdeem weisen eis Daten och datt den N-Terminus spezialiséiert ass fir Protein-zu-Protein Interaktiounen.D'IFNAR2 bindend Site läit tëscht Reschter 312-368, a notamment, keng vun de Proteinen am Komplex binden zu dëser Regioun (Figebam. 4A) 37,38.Dës Daten zesumme geholl weisen datt d'IFNAR2 bindend Domain exklusiv vum Rezeptorprotein benotzt gëtt.Zousätzlech goufen nëmmen OAS3 an ROBO1 fonnt fir mat Domänen upstream vum N-Terminus an IFNAR2 bindend Site (Dorënner 4A) verbonnen ze sinn.
ROBO1 gehéiert zu der Immunoglobulin (Ig) Superfamilie vun transmembrane Signalmoleküle a besteet aus fënnef Ig Domainen an dräi Fibronectin (Fn) Domainen an der extrazellulärer Regioun.Dës extrazellulär Domänen ginn gefollegt vun enger Membran-proximaler Regioun an enger eenzeger transmembrane Helix 39. Eng onstrukturéiert intrazellulär Regioun läit um C-Terminus an enthält konservéiert Sequenzmotiven déi Effektorproteinbindung39 vermëttelen.D'Regioun, déi sech vun Aminosäuren ~1100 bis 1600 verlängert, ass meeschtens gestéiert.Mir hunn erausfonnt datt MX1 mat ROBO1 duerch Ig, Fn an intrazelluläre Beräicher interagéiert, während déi meescht Interaktioune mat STAT1 tëscht senger CCD, Linker Domain an dem C-Terminus vun ROBO1 (Figebam. 4A, E) geschéien.Op der anerer Säit, Interaktioune mat DI, DIII, an OAS3 Linker Regioune sech ganze ROBO1 Protein verdeelt (Figebam. 4A).
D'oligoadenylate Synthase (OAS) Protein Famill akzeptéiert a bindet intrazellulär duebel-stranded RNA (dsRNA), mécht conformational Ännerungen, a synthetiséiert 2',5'-verbonne Oligoadenylates (2-5 As) 40.Et gouf fonnt datt tëscht den dräi OASen OAS3 déi héchst Affinitéit fir dsRNA weist an déi mannst Quantitéit vun 2-5 As synthetiséiert, wat RNase L aktivéiere kann an doduerch viral Replikatioun 41 limitéieren.D'OAS Famill besteet aus Polymerase Beta (pol-β)-ähnlechen Nukleotidtransferase Domainen.Virdrun Fuerschung huet gewisen datt d'katalytesch Aktivitéit vum C-terminale Domain (DIII) ofhängeg ass vum dsRNA-bindende Domain (DI), wat fir d'Aktivatioun vun OAS342 erfuerderlech ass.Mir observéiert datt d'DI an DII Domainen vun OAS3 mat CCD interagéieren an eng kleng Kräizung Regioun tëscht SH2 an STAT1 TAD (Dorënner 4A, F).Iwwerlagerung vu verschiddene Crosslinking Siten op der Proteinstruktur huet eng Interaktioun tëscht der β-Blat an der DBD STAT1 Loop an enger oppener Tasche oder Huelraim geformt vu Reschter 60-75 am DI Domain vun OAS3 (Fig. 4G).D'Orientéierung vun de Proteinen am Komplex huet och uginn datt keng vun den Interaktiounen mat OAS3 d'DNA-bindende Fähigkeit vu sengem DI-Domain gestéiert huet (Figebam. S1A).Zousätzlech interagéiert d'N-terminal Domain vun GTPase MX1 extensiv mat den DI an DIII Domainen vun OAS3 (Fig. 4A).Mir hunn och eng Interaktioun tëscht OAS1 an MX1 an all dräi IFNα-behandelt Wiederholungen observéiert, wou eng eenzeg OAS1 Domain (och katalytesch aktiv) mat allen dräi MX1 Domainen interagéiert huet (Dorënner S2A, B).
MX Proteine ​​sinn Deel vun enger grousser Famill vun dynein-ähnlechen GTPases déi en N-terminal GTPase Domain enthalen deen GTP bindt an hydrolyséiert, en Zwëschendomän dat Selbstversammlung vermëttelt, an e C-terminal Leucin Zipper deen als GTPase wierkt (LZ) ).Domain Effektor Domain25,43.MX1 bindt un Ënnerunitéite vu virale Polymerasen fir d'Transkriptioun vum virale Gen43 ze blockéieren.E virdru gemellt Hef zwee-Hybrid Écran huet gewisen datt PIAS1-assoziéiert MX1 STAT1-mediéiert Genaktivéierung hemmt andeems d'DNA-bindend Aktivitéit blockéiert an och SUMO E344,45 Ligase Aktivitéit huet.Hei beweise mir datt MX1 un STAT1 bindt (Dorënner 4C, D), awer wéi dës Interaktioun STAT1-mediéiert Genaktivéierung beaflosst an Äntwert op IFNα brauch weider Studie.Zousätzlech hu mir och fonnt datt MX1 mat IFIT3 an DDX60 an allen dräi IFNα-behandelt Wiederholungen interagéiert (Figebam. S2C).
DDX60 ass eng IFN-induzéiert zytoplasmatesch Helicase déi virdru gemellt gouf eng Roll an der RIG-I-onofhängeger Degradatioun vu virale RNA46 ze spillen.Et interagéiert mat RIG-I an aktivéiert seng Signalisatioun op eng ligandspezifesch Manéier 46. DDX60 besteet aus engem DEXD / H-Box Helicase Domain an engem C-terminal Helicase Domain, déi viral RNA an DNA47 binden.Déi meescht vu senge Interaktioune mat MX1 an IFIT3 geschéien bannent laange N- an C-terminal Regiounen ouni kanonesch Beräicher oder Motiver (Figebam. S2E, F).Allerdéngs ass MX1 och mat der DEXD /H-Box Helicase Domain assoziéiert (Figebam. S2E).Proteine ​​vun der IFIT Famill hunn Tandem Exemplare vun engem markanten Helix-Turn-Helix-Motiv genannt Tetrapeptid Wiederholung (TPR).IFIT3 gouf fonnt als e positiven Modulator vun der RIG-I Signaliséierung an dofir e Bestanddeel vum MAVS Komplex.Zesummegefaasst suggeréieren eis Donnéeën datt IFIT3 an DDX60 haaptsächlech an der Regioun tëscht TPR 3-6 vun IFIT3 interagéieren a kënnen eng Roll bei der RIG-I / MAVS Signaliséierung spillen (Fig. S2F).
Gitt datt d'Screening vum ganze Proteome computationell intensiv ass, hu mir dunn déi ganz mënschlech UniProt Datebank fir d'Präsenz vun enger vun den IFNα-behandelte Widderhuelunge gescreen.An dëser Replik hu mir e puer héich zouverlässeg Interaktiounsnetzwierker fir HLA-A fonnt.Analyse vun Protein Weeër identifizéiert vun MS /MS Spektrum gewisen, datt MHC-ech-baséiert antigen Veraarbechtung a Presentatioun den Haapt Wee vun Interferon entschlof ass (Figebam. 3D).Dofir hu mir eis konzentréiert fir d'Proteininteraktioune vu MHC-I Molekülle mat engem héije Grad vu Vertrauen an all vernetzten Echantillon ze studéieren.HLA besteet aus α1, α2 an α3 Domainen a Liichtketten, a Mikroglobulin β2 (β2m) ass e konstante Chaperoneprotein49.Eemol am endoplasmatesche Retikulum gesammelt, ass HLA onbestänneg an der Verontreiung vu Peptidliganden50.D'peptidbindende Groove gëtt geformt vun den héich polymorpheschen an onstrukturéierten α1- an α2-Domänen an net-Peptidform an dem relativ manner polymorpheschen α351-Domän.An der Präsenz vun IFNα, hu mir zwee HLA-A Komplexe festgestallt: een interagéiert mat HMGA1 an H2B (Dorënner 5, Table S3) an déi aner interagéiert mat MDN1, LRCH4 an H2B (Dorënner 6).
IFNα induzéiert en HLA-A Interaktiounsnetz mat H2B (H2BFS) an HMGA1.(A) 2D Plot (generéiert an der SIM-XL Software) déi verschidden Aarte vun Interaktiounen am H2B-HLA-A-HMGA1 Komplex duerstellt: Interlink (blo), Interlink (rout) an eenzeg Link (schwaarz)..Domains vu verschiddenen Identitéiten si Faarfkodéiert32: H2B (Histone; 2-102) an MHC-I (MHC_1; 25-203, Grupp C1; 210-290 an MHC_I_C; 337-364).De Cross-Link Schwell gouf op 3,5 gesat.Dot Plots weisen HLA-A Interaktiounsplaze mat H2B (B) an HMGA1 (C), souwéi K oder S Interaktiounsplazen tëscht den zwee Peptiden.An der Figur ass de Cross-Link Score-Schwell op 3.0 gesat.(D) Bezéiungen tëscht Proteinen, déi an de Strukture vun den H2B, HLA-A, an HMGA1 Proteinen am PyMOL Programm gewisen ginn.Dës Strukture goufen mam Phyre2 Server (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) modelléiert an d'Schablounstrukture fir d'H2B, HLA-A an HMGA1 Proteine ​​waren 1kx552, 1kj349 an 2eze55, respektiv.
IFNα induzéiert en HLA-A Interaktiounsnetz mat H2B (H2BFS), MDN1 an LRCH4.(A) Intramolekulär (rout) an intermolekulär (blo) Crosslinks presentéiert op enger 2D interaktiver Kaart (generéiert an der SIM-XL Software) mat MDN1 representéiert als Krees.De Cross-Link Schwell gouf op 3,5 gesat.Domains vu verschiddenen Identitéiten si Faarfkodéiert32: H2B (Histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, Grupp C1; 210–290 an MHC_I_C; 337–364) an LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) an CH (535–641)).(B) Bezéiungen tëscht Proteinen, déi an de Strukture vun den H2B, HLA-A, LRCH4, an MDN1 Proteinen am PyMOL Programm gewisen ginn.Dës Strukture goufe mam Phyre2 Server (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) mat Schablounstrukturen 1kx552, 1kj349, 6hlu62 an 6i2665 fir d'H2B, HLA-A, LRCH4 an MDN1 Proteine ​​​​modelléiert, respektiv.Punkt Komplott weist K oder S Interaktioun Siten fir HLA-A mat H2B (C), LRCH4 (D), an MDN1 (E).Fir Komplott gouf de Cross-Link Score-Schwell op 3.0 gesat.
Zousätzlech fir d'Integritéit vum Genom z'erhalen, ass Histon H2B och an der Reguléierung vun der Transkriptioun involvéiert.Den H2B Protein besteet aus engem zentrale Histon Domain (HFD) geformt vun dräi α-Helice getrennt vu Schleifen an engem C-terminalen Schwanz 41,52.Déi meescht vun der Interaktioun mat H2B geschitt an der α1 Helix, déi Trimeriséierung mam HFD Heterodimer (Fig. 5A, B) ubitt.Och wann Lysine an DNA Bindung involvéiert sinn, sinn e puer Lysine och alternativ Acetylatiouns- oder Methylatiounsplazen.Zum Beispill, Reschter K43, K46, a K57 aus H2B sinn net an direkt DNA Bindung involvéiert, mee sinn Ziler vun verschiddenen post-transcriptional Modifikatioune53.Ähnlech kënne Reschter K44, K47 a K57 an H2B eng alternativ Roll an der Präsenz vun IFNα spillen, och Interaktioune mat anere Proteinen (Lalumi 5A, B).Zousätzlech aktivéiert den extrachromosomalen Histon H2B d'Immunreaktioun a verschiddenen Zelltypen, wierkt als zytosolesche Sensor fir duebelstrengeg DNA (dsDNA) Fragmenter z'entdecken, déi aus infektiiv Agenten oder beschiedegt Zellen ofgeleet ginn54.An der Präsenz vun DNA Viren, H2B Ausschöpfung hemmt IFN-β Produktioun an STAT154 Phosphorylatioun.H2B ass och bekannt fir an an aus dem Kär méi séier ze beweegen wéi aner Kärhistone54.H2B Interaktioune mat MDN1 an LRCH4 goufen och an ausgewielt onbehandelt Echantillon observéiert.Mir hu festgestallt datt HLA-A mat H2B an allen dräi IFNα-behandelte Proben interagéiert an an enger onbehandelt Widderhuelprobe.Dës Donnéeë reflektéieren d'Roll vum H2B an enger alternativer physiologescher Funktioun onofhängeg vun der Transkriptiounsreguléierung.
HMGA1 (High Mobility Group AT-Hook 1), e klengen Nukleoprotein reich an Krankheet-förderend Aminosäuren, gouf a Verbindung mat HLA-A identifizéiert.Et huet e sauer C-terminal Schwanz an dräi ënnerschiddlech DBDs genannt AT Haken, well se un d'Minor Groove vun der AT-räicher Regioun an dsDNA55,56 binden.Dës Bindung verursaacht d'DNA ze béien oder ze riichten, wat erlaabt kanonesch Transkriptiounsfaktoren op seng Konsens Sequenz ze kommen.De C-terminale Schwanz gëtt ugeholl datt se u Protein-Protein Interaktiounen an der Rekrutéierung vun Transkriptiounsfaktoren involvéiert sinn, well C-terminal Läschmutanten net fäeg sinn d'Transkriptioun57 ze initiéieren.Ausserdeem enthält dëst Domain verschidde konservéiert Phosphorylatiounsplazen déi bekannte Substrate fir Kinasen 58 sinn.Mir observéiert HLA-A an H2B Interaktioune mat HMGA1 ausserhalb der C-Uschloss Domain, suggeréiert datt d'C-Uschloss Domain haaptsächlech fir Transkriptiouns Faktor bindend benotzt gëtt (Lalumi 5A, C).HMGA Proteinen konkurréiere mam Histon H1 fir d'Bindung un den Adapter DNA, an doduerch d'Accessibilitéit57 ze erhéijen.Ähnlech schéngt et wahrscheinlech datt HMGA mat Histon H2B laanscht de Linker DNA interagéiert a Konkurrenz mam Histon H1.HMGB1 induzéiert den Ausdrock vun HLA-A, -B, an -C an dendritesch Zellen, wat zu hirer Aktivatioun féiert59, awer eng Interaktioun tëscht HMG an HLA ass net virdru gemellt ginn.Mir hu fonnt datt HMGA1 mat den α1 an α3 Domainen vun HLA-A interagéiert, mat de meeschte vun den Interaktiounen ausserhalb vu sengem 3 DBD (Dorënner 5A, C).An eisen Hänn gouf HLA-A fonnt datt se am Kär lokaliséiert sinn (Daten net gewisen), a well H2B an HMGA1 och am Kär präsent sinn, geschitt dës Interaktioun méiglecherweis am Kär.Spezifesch Addukten gemooss tëscht H2B, HLA-A, an HMGA1 sinn an der Figur 5D gewisen.
Déi meescht Interaktioune vun HLA-A mat anere Proteinen geschéien bannent sengen α1 an α2 Beräicher an der gestéiert C-terminal Domain (Fig. 6).An engem vun dëse Beispiller hu mir festgestallt datt HLA-A mat dem gestéierten N-terminalen Schwanz vum LRCH4 interagéiert (Dorënner 6A, D).LRCH4 reguléiert TLR4 Aktivatioun an LPS Zytokin Induktioun, moduléiert doduerch déi gebierteg Immunantwort60,61.Et ass e Membranprotein mat néng leucinräiche Wiederholungen (LRRs) an engem Calmodulin (CH) Homologiemotiv a sengem Ektodomain, gefollegt vun engem transmembrane Domain (TMD) 60, 62.CH Domänen goufen gemellt fir Protein-Protein Interaktiounen 60 ze vermëttelen.Eng Streck vu ronn 300 Aminosäuren tëscht den LRR- a CH-Domänen ass relativ zougänglech, awer gestéiert.Baséierend op d'Funktioun vun gestéiert Regiounen als Vermëttler vu Protein-Protein-Netzwierker a vesikulären Transport 63, hu mir festgestallt, datt déi meescht Protein-Interaktiounen an gestéierte Regiounen optrieden.Interaktioune mat MDN1 sech uechter d'Längt vun der FAQ verdeelt, dorënner de LRR1, LRR6, CH Beräicher, an zoufälleg Regiounen, iwwerdeems H2B haaptsächlech un der CH Domain gebonnen (Lalumi 6A, B).Notamment huet keng vun den Interaktiounen den TMJ abegraff, wat d'Spezifizitéit vun der CLMS Approche suggeréiert (Dorënner 6A, B).
MDN1 ass och als Deel vun der HLA-A Protein Reseau identifizéiert ginn (Dorënner 6A).Et gehéiert zu der AAA Famill vu Proteinen (ATPasen verbonne mat verschiddenen Aktivitéiten).Dëst ass datselwecht N-terminal AAA Domain, deen an en hexameresche Ring organiséiert an den Assembléefaktor vun der 60S 64 ribosomaler Ënnerunitéit läscht.schéngt ähnlech ze dynein64,65,66.Zousätzlech ass d'Asp / Glu räich Regioun gefollegt vum MIDAS Domain (Metalion-ofhängeg Site).Wéinst der grousser Gréisst vum MDN1 (ongeféier 5600 Aminosäuren) a senger limitéierter Homologie mat gutt studéierte Proteinen, ass wéineg iwwer seng Struktur a Funktioun am Mënsch bekannt.Mir identifizéiert HLA-A, H2B, an LRCH4 als MDN1 bindend Partner an verroden hir Orientatioun als Protein komplex an PyMol (Lalumi 6A, B).Dës dräi Proteinen interagéiere mam AAA Domain, dem Dynein-ähnlechen Linker Domain, a méiglecherweis dem MIDAS MDN1 Domain.An engem fréiere Rapport, Affinitéit Reinigung vun Köder Proteinen identifizéiert MDN1 als Protein verbonne mat histon H2B67.Zousätzlech huet eng rezent Etude och eng Interaktioun tëscht MDN an HLA-B an HCT116 Zellen gemellt mat Affinitéit-gereiniger Massespektrometrie, déi eis Erkenntnisser ënnerstëtzen68.D'Identifikatioun vun dësem Komplex an IFNα-behandelte Proben suggeréiert eng Roll fir MDN1 an der Interferon Signaliséierung.
Well HLA Genen héich polymorphic sinn, extrahéiert mir sequencing liesen Kaarte HLA-A, -B, an -C aus RNA sequencing Donnéeën vun Flo-1 Zellen (Donnéeën net gewisen).Peptid Sequenzen, déi konsequent mat der Sequenzéierungsliesung verroden hunn bedeitend Differenzen tëscht HLA-A, -B, an -C a Regiounen wou vernetzten Peptiden an HLA-A lokaliséiert waren (Dorënner S3).Zousätzlech, hu mir net Protein-zu-Protein Kräiz-Verbindung vun HLA-B /C Molekülle mat H2B /HMGA1 /MDN1 /LRCH4 Proteinen observéiert.Dëst hindeit datt d'Protein Interaktioun tëscht HLA-A, MDN1, LRCH1 an HMGA1 HLA-A spezifesch ass.Zousätzlech huet proteomesch Analyse vun net-vernetzte Proben (Table S4) gewisen datt HLA-A méi héich Sequenzofdeckung am Verglach zu HLA-B oder HLA-C huet.D'Peptiden identifizéiert fir HLA-A waren héich an der Intensitéit a béid IFNα-behandelt an onbehandelt Proben.
Fir sécherzestellen datt d'Interaktiounen, déi hei identifizéiert goufen, net duerch net-spezifesch Cross-linking vun zwee Proteinen an der noer raimlecher Noperschaft waren, bestätegt mir weider zwee nei HLA-A interagéierend Faktoren andeems se Co-Immunoprecipitatiounsassays ausféieren.HLA-A Interaktioune mat endogenous MDN1 an H2B sech souwuel IFNα-behandelt an onbehandelt Flo-1 Zellen fonnt (Dorënner 7, Dorënner S4).Mir bestätegt datt HLA-A vun H2B an den Immunoprecipitaten ageholl gouf an datt dës Associatioun wéinst der IFNα Behandlung war, well HLA-A an den Immunoprecipitate Echantillon vun onbehandelt Zellen (Dorënner 7A) fehlen.Wéi och ëmmer, eis Donnéeën hindeit datt IFNα differenziell HLA-A bindend zu H2B an MDN1 reguléiert.IFNα induzéiert Associatioun tëscht H2B an HLA-A, awer reduzéiert seng Associatioun mat MDN1.Mir hunn erausfonnt datt MDN1 mat HLA-A a Kontrollen verbonne war, an d'Zousatz vun IFNα reduzéiert dës Interaktioun onofhängeg vun der MDN1 Aféierung vun IFNα (Dorënner 7B, C).Zousätzlech, HLA-A immunoprecipitation ageholl H2B zu A549 Zellen (Lalumi S4), suggeréiert datt dës Interaktioun vun Zell Typ onofhängeg ass.Zesummegefaasst ënnerstëtzen dës Resultater interferon-mediéiert Interaktioune vun HLA-A mat H2B an MDN1.
HLA-A co-purifizéiert H2B an MDN1.Vertrieder endogenous H2B (A) an MDN1 (B) immunoblots sech immunoprecipitated aus IFNα-behandelt Flo-1 Zellen an probed fir déi uginn antibodies.Maus an Kanéngchen IgG goufen als negativ Kontroll benotzt.(C) Relativ Quantitéiten (Input) vun verschiddenen antigens sinn duergestallt vun immunoblots probed géint uginn antibodies, β-actin war als Luede Kontroll benotzt.
Déi strukturell Eegeschafte vun engem vun den interferon-induzéierten héich zouverléissege vernetzte Netzwierker, H2B-HLA-A-HMGA1, goufen ënnersicht.Mir hunn molekulare Dynamik Modeller als alternativ Approche benotzt fir d'Konformatiounsdynamik vun de Proteinen, déi an dësem Komplex involvéiert sinn, ze verstoen (Dorënner 8).Inferenzen aus den CLMS-Daten suggeréieren d'Méiglechkeet vu verschiddene Konformatiounen vun den H2B, HLA-A, an HMGA1 Proteinen.Dofir goufen déi folgend potenziell Komplexe an engem Léisungsmëttelmedium modelléiert: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, an H2B-HLA-A-HMGA1.En initialen Protein-Protein-Docking-Bildschierm mat dem MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Québec, Kanada) Package proposéiert méiglech Konformatiounen déi tëscht dëse Proteinen ënnerscheeden (Fig. 8A).Visualiséierung vum Dockingproteinkomplex huet verschidde Interaktiounen a méiglech Konformatiounen opgedeckt (Dorënner 5A, 8).Also ass eng méiglech Konformatioun an der Figur 8A gewisen (mat markéierte Cross-Links) an et gouf weider mat der MD Modelléierungspipeline bewäert.Zousätzlech, Bindung vun H2B oder HMGA1 zu HLA-A Highlights déi héich Affinitéit vun H2B fir HLA-A (Lalumi 8A).
Konformational Dynamik vu méiglechen Netzwierker tëscht den H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, an H2B-HLA-A-HMGA1 Komplexen.(A) Lénks Panel ass eng 2D Kaart (generéiert an der SIM-XL Software) vun intramolekuläre (roude) an intermolekuläre (bloe) Crosslinks (Crosslink Cutoff op 3.5 gesat).Zousätzlech, identifizéiert Kräizverbindungsreschter sinn op de Strukture vun den H2B, HLA-A, an HMGA1 Proteinen markéiert.Déi assoziéiert Konformatiounen vun dëse Proteine ​​goufen extrahéiert mat der Docking Pipeline implementéiert am MOE Package.Déi ënnescht lénks Panel weist déi verschidde méiglech Konformatiounen vun den H2B-HLA-A- an HMGA1-HLA-A-Komplexe mat verschiddene Protein-Protein-bindend Affinitéiten (GBVI / WSA dG; kcal /mol).(B) Standarddeviatioun (RMSD) vun atomarer Positiounen (ausser Waasserstoff Atomer) fir all Protein Struktur.(C) Intermolekulare Protein-Protein Waasserstoffbindungsinteraktiounen aus verschiddene simuléierte Komplexe berécksiichtegt spezifesch Interaktiounen vun Dauer ≥ 10 ns.D'H-Bond Donor-Acceptor cutoff Distanz war op 3,5 Å gesat, an den Donor-H-Acceptor cutoff Wénkel war op ≥ 160 ° -180 ° gesat.(D) Label Reschter déi HLA-A Protein-Protein Interaktioune mat hire jeweilege Partner bilden, spannen ≥ 20 ns, extrahéiert aus Dummy HLA-A-H2B an HLA-A-HMGA1 Komplexen.Proteinstrukture representéieren eng duerchschnëttlech Struktur vun 100 ns MDS.(E) Interaktiounen tëscht HLA-A-H2B an HLA-A-HMGA1 Komplexen am Verglach mat Interaktiounen, déi duerch H2B-HLA Simulatioun iwwer 100 ns verfollegt ginn, baséiert op der K oder S Interaktiounsplaz tëscht den zwee Peptiden.Komplexen /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.De Schwellwäert fir d'Evaluatioun vu Cross-Links gouf op 3.0 gesat, a spezifesch Interaktioune vu MDS, déi ≥ 10 ns huelen, goufen berücksichtegt.Proteinstrukture goufen visualiséiert mat BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) a Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Québec, Kanada) Packagen.
D'Stabilitéit vun HLA-A Molekülle iwwer Zäit (Standard deviation; RMSD oder Standard deviation; RMSF) uginn datt d'Präsenz vun H2B oder HMGA1 Proteinen an de Komplexe stabiliséiert HLA-A (Dorënner 8B, Dorënner S5).Den HMGA1 Protein bindt enk un de B2M Site vun HLA-A, wat d'Stabilitéit vun den HLA-A Aminosäuren am HLA-A-HMGA1 oder H2B-HLA-A-HMGA1 Komplex induzéiert (Dorënner 8B, Figur S5).besonnesch, HLA Reschter ~ 60-90 an ~ 180-210 goufen manner flexibel an der Präsenz vun H2B fonnt (Fig. 8B).H2B an HMGA1 zougedréckt besser Bindung zu HLA-A am H2B-HLA-A-HMGA1 komplex Verglach zu HLA-A Bindung zu H2B oder HMGA1 eleng (Dorënner 8C, D; Table S5).Reschter, déi an der Waasserstoffverbindung involvéiert sinn (MD modelléiert héich Besetzung ≥ 10 ns) fällt mat CLMS Interaktiounsplazen (K oder S Reschter) am Komplex zesummen, wat suggeréiert datt d'Interaktiounen, déi duerch CLMS identifizéiert sinn, ganz zouverlässeg sinn.Zouverlässegkeet (Fig. 8E).An CLMS an MD Modeller, HLA-A Reschter tëscht ongeféier 190-210 an ongeféier 200-220 Aminosaier Saieren goufen fonnt H2B an HMGA1 ze binden, respektiv (Fig. 8E).
Protein-Protein Interaktiounen bilden dynamesch strukturell Netzwierker déi intrazellulär Kommunikatioun als Äntwert op bestëmmte Reizen vermëttelen.Well vill Proteomics Approche Verännerungen am allgemenge Steady-State Niveau vun engem Protein erkennen, erfuerdert Protein-Protein Interaktiounsdynamik zousätzlech Tools fir bindend Interfaces z'erfëllen, an CLMS ass ee sou Tool.Den Interferon-Signalsystem ass en Zytokinennetz dat Zellen erlaabt op eng Rei vun Ëmweltpathogenen an intrinsesche pathologesche Signaler z'äntwerten, déi an der Induktioun vun Ënnersätz vun interferon-induzéierbaren Proteinen kulminéieren.Mir hunn CLMS ugewannt fir ze bestëmmen ob nei Protein-Protein Interaktiounen ënner engem Panel vun interferon-induzéierte Proteinen identifizéiert kënne ginn.Global Protein Cross-Linking Analyse an engem interferon-reaktiounsfäeger Flo-1 Zellmodell gouf benotzt fir Proteinkomplexe z'erfaassen.Extraktioun vun tryptesche Peptiden aus net-vernetzten a vernetzten Zellen erlaabt Peptidzielen, Weeberäicherung a Peptidlängtverdeelung mat definéiert LFQ Intensitéit.Canonical interferon-inducible Proteinen goufen als positiv intern Kontroll identifizéiert, während nei intermolecular an intramolecular cross-linked adducts vun kanoneschen interferon-inducible Proteinen wéi MX1, UP18, OAS3 an STAT1 observéiert goufen.Verschidde strukturell Funktiounen an Interaktiounen a funktionnelle Beräicher goufen ënnersicht.
Eng Interaktioun tëscht HLA-A, MDN1 an H2B gouf duerch immunoblotting an Flo-1 an A549 Zellen erkannt behandelt an onbehandelt mat IFNα.Eis Resultater Highlight datt HLA-A Komplexe mat H2B op eng IFNα-ofhängeg Manéier.Eis Aarbecht stellt eng interessant Avenue duer fir weider Exploratioun vun der Co-Lokaliséierung vun dësen zwee Komplexen.Et wier och interessant d'CLMS Approche zu engem Panel vun Zelllinnen auszebauen fir Zell-Typ-onofhängeg interferon-vermittelt Protein Interaktiounen z'identifizéieren.Schlussendlech hu mir MD Modelléierung als alternativ Approche benotzt fir d'konformational Dynamik vu Proteinen, déi am H2BFS-HLA-A-HMGA1 Komplex involvéiert sinn, ze verstoen, déi intramolekulär an intermolekulär Kräizgespréicher verfollegt hunn.Inferenzen aus den CLMS-Daten suggeréieren d'Méiglechkeet vu verschiddene Konformatiounen vun den H2BFS, HLA-A, an HMGA1 Proteinen.Déi méiglech verschidde Konformatiounen tëscht dësen Docking-Protein-Komplexen hunn e puer Interaktiounen opgedeckt ähnlech wéi déi, déi an der CLMS-Dateset observéiert goufen.Eng vun den Haaptstäerkten vun eiser Method ass datt et eng einfach Identifikatioun vun interagéierend héich polymorphesche Genen wéi HLA erlaabt, also wäert et interessant sinn Interaktioune vun HLA Haplotype-spezifesche Proteinen ze studéieren déi soss schwéier ze studéieren.Zesummegefaasst weisen eis Donnéeën datt CLMS ka benotzt ginn fir eise Verständnis vun interferon-induzéierte Signalnetzwierker auszebauen an eng Basis ze bidden fir méi komplex interzellulär Systemer an der Tumormikro-Ëmfeld ze studéieren.
Flo-1 Zellen sech aus ATCC kritt an obgehaal an DMEM (Gibco) ergänzt mat 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen), 10% Fetal Bovine serum (Gibco) a bei 37 ° C an 5% CO2 gespäichert.Inkubatioun.Zellen goufen zu 70-80% Zesummefloss ugebaut ier se mat IFNα14 behandelt ginn (fabrizéiert vun Edinburgh Protein Production Facility).All aner Chemikalien a Reagenzë goufen vum Sigma Aldrich kaaft, ausser anescht uginn.
Flo-1 Zellen sech an 6-gutt Placke cultured an den nächsten Dag d'Zellen sech mat 10 ng /ml IFNα14 fir 24 Stonnen bis ongeféier 80% Zesummefloss behandelt.Zellen goufen dräimol mat PBS gewäsch a mat frësch preparéierten DSS (Thermo Fisher Scientific) (opgeléist an DMSO) an PBS fir 5 min bei 37 ° C. bis zu enger final Konzentratioun vun 0,5 mM ligéiert.D'DSS Crosslinking Reaktioun gouf mat PBS ersat an de Rescht DSS gouf ofgeschwächt andeems 20 mM Tris (pH 8.0) an PBS fir 15 min bei 37 ° C bäigefüügt gouf.Zellen goufen duerch Schrauwen gesammelt a gesammelt an niddereg bindend Réier (Axygen).
D'Zellpellet gouf mat 300 μl Harnstoff-Lysis-Puffer (8 M Harnstoff, 0,1 M Tris, pH 8,5) fir 30 min bei Raumtemperatur mat heiansdo schüttelen lyséiert.All centrifugation Schrëtt sech bei 14.000 xg bei 8 ° C gesuergt.Zentrifuge de Lysat fir 10 Minutten a transferéiert de Supernatant an en neit Rouer.Déi reschtlech kloer Partikel goufen an 150 μl vum zweete Lysisbuffer (2 M Harnstoff, 2% (w/v) SDS (Natriumdodecylsulfat)) fir 30 Minutten oder méi opgeléist bis eng homogen wässerlech Léisung kritt gouf.D'Lysat gouf fir 20 Minutten centrifugéiert an de Supernatant gouf mat dem Lysat, deen am virege Schrëtt kritt gouf, gemëscht.Protein Konzentratioune goufen mat der Micro BCA Assay (Thermo Fisher Scientific) bewäert no den Instruktioune vum Hiersteller fir Mikroplateprozeduren.D'Probe goufen séier a flëssege Stickstoff gefruer a bei -80 ° C gelagert.
Ongeféier 100 μg vun lösleche vernetzten Protein gouf mat engem modifizéierte Filtratiounsprobe Preparatiounsprotokoll (FASP) veraarbecht wéi vum Wisniewski et al.69 Kuerz gesot, de Protein ass vernetzt mat 200 μl Harnstoffbuffer (8 M Harnstoff an 0,1 M Tris, pH 8,5), gewirbelt an halbéiert.All centrifugation Schrëtt goufen um 14.000 xg bei 25 ° C gesuergt.Déi éischt Halschent vum vernetzten Proteinlysat gouf op en 10 kDa Microcon Zentrifugalfilterapparat equipéiert mat enger Ultracel-10 Membran (Merck), gefollegt vun der Zentrifugatioun um Filter fir 25 Minutten.Füügt dann déi zweet Halschent vum Protein an de Filter a widderhuelen déiselwecht Schrëtt.Protein Erhuelung gouf gemaach andeems 100 μl 17 mM Tris (2-Carboxyethyl) Phosphinhydrochlorid (TCEP) am Harnstoffbuffer bäigefüügt gouf.Erhuelung gouf op engem Thermomixer bei 600 rpm fir 30 min bei 37 ° C gerührt.Zousätzlech gouf d'Kolonn centrifugéiert an de reduzéierte vernetzte Protein gouf alkyléiert mat 100 μl 50 mM Iodacetamid am Harnstoffbuffer.D'Alkyléierungsreaktioun gouf bei Raumtemperatur fir 20 Minutten an der Däischtert duerchgefouert.Rotéiert d'Kolonn, wäscht d'Kolonnmaueren 3 Mol mat 100 µl Harnstoffbuffer, an centrifugéiert dann.Déi selwecht Operatioun gouf 3 Mol mat 100 μl 100 mM Ammoniumbikarbonat gemaach.Virun Trypsiniséierung, ersetzen d'Sammlungsröhre mat engem neien.Füügt Verdauungsbuffer mat 50 mM Ammoniumbikarbonat an 1 μl Trypsin verdënntem an Trypsinbuffer (Promega).D'Verhältnis vun Trypsin zu Protein war bei ongeféier 1:33 erhale gelooss, an Verdauungsreaktiounen goufen iwwer Nuecht bei 37 ° C. an engem fiichten Chamber incubated.De vernetzten Peptid gouf aus dem Filter duerch Zentrifugatioun fir 25 Minutten eluéiert.D'Peptid Erhuelung gouf verbessert andeems 50 μl 0,5 M NaCl an de Filter bäigefüügt gouf, gefollegt vun der Zentrifugéierung fir 25 Minutten.
C18 Mikro Spin Sailen (Harvard Apparat) goufen zu desalting Kräiz-verbonne tryptic peptides folgende de Protokoll beschriwwe vun Bouchal et al.70 mat kleng Ännerungen benotzt.Kuerz gesot, C18 Spin Sailen goufen mat dräi Wäschen vun 0,1% Mieresäure (FA) an Acetonitril (AcN) (Merck) an zwee Wäschen vun 0,1% FA aktivéiert.D'Kolonn gouf mat 0,1% FA fir 15 Minutten hydratiséiert.Lued Echantillon an spin Kolonnen a wäschen 3 Mol mat 0,1% FA.Déi desalted Peptiden goufen sequentiell mat engem stepwise Gradient mat 50%, 80% an 100% AcN an 0,1% FA eluéiert.D'Probe goufen an engem SpeedVac Plus Konzentrator (Eppendorf) getrocknegt bis déi Reschtflëssegkeet komplett verschwonnen ass.Déi eluéiert Peptiden goufen an 100 μl vun 0,08% Trifluoroacetic Seier an 2,5% AcN opgeléist an d'Konzentratioune goufen op engem NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) gemooss.Ongeféier 1 μg vu vernetzten Peptid pro Probe gouf an den LC-MS /MS System injizéiert.
Cross-linked Peptiden goufen op engem UltiMate 3000 RSLCnano LC System (Thermo Scientific) getrennt, verbonne mat engem Orbitrap Exploris 480 Massespektrometer (Thermo Scientific).Cross-linked Peptiden goufen op enger 300 µm ID gesammelt, 5 mm laang µ-Pre-Kolonn C18 Capture Kolonn gepackt mat C18 PepMap100 Sorbent a 5 µm PepMap Sorbent (Thermo Scientific).Lued de Pompelstroum op 5 μl / min 0,08% Trifluoresdiksäure opgeléist an 2,5% AcN.Cross-linked Peptiden goufen op enger analytescher verschmolzen Silica Kolonn mat engem banneschten Duerchmiesser vu 75 μm an enger Längt vun 150 mm getrennt, gefëllt mat engem 2 μm PepMap Sorbent (Thermo Scientific).Mobil Phasen A a B bestinn aus 0,1% FA am Waasser an 0,1% FA am Acetonitril, respektiv.De Gradient fänkt bei 2,5% B un a klëmmt linear op 40% B iwwer 90 Minutten, dann op 90% B iwwer déi nächst 2 Minutten.D'mobil Phase Zesummesetzung gouf bei 90% B fir 10 Minutte behalen an dann linear op 2,5% B iwwer 2 Minutten erofgaang.D'Kolonn gouf bei 2,5% B fir 8 Minutte virum nächsten Zyklus equilibréiert.Cross-linked Peptiden, déi aus der analytescher Kolonn eluéiert goufen, goufen an enger Nanoelectrospray Ioniséierung (NSI) Quell ioniséiert an an en Exploris 480 Massespektrometer (Thermo Scientific) injizéiert.
Den Orbitrap Exploris 480 Massespektrometer huet am positiven Datekorrelatiounsmodus operéiert.E komplette Scan gouf am Sektiounsmodus mat enger Resolutioun vun 120.000 gemaach mat Range-Astellunge vu m/z 350 Th bis m/z 2000 Th.D'normaliséiert AGC Zil gouf op 300% mat enger maximaler Input Zäit vun 50ms festgeluecht.Monoisotopesch Peak Detektioun gouf fir Peptiden etabléiert.De Contraint Entspanungsparameter ass op richteg gesat wann ze wéineg Virgänger fonnt ginn.D'Mindest Ionesch Stäerkt vum Virgänger gouf op 5.0e3 gesat an d'Virgängerladungsstate bis +8 goufen an den Experimenter abegraff.
D'Zykluszäit tëscht grousse Scannen am Datekorrelatiounsmodus gouf op 2,5 Sekonnen gesat.Dynamesch Mass Ausgrenzung war op 20 s no der éischter Fragmentatioun vun der Virleefer Ion gesat.D'Virgänger Isolatiounsfenster gouf op 2 Th gesat.D'Zort vun normaliséierter Kollisiounsenergie mat engem fixen Kollisiounsenergie-Modus gouf an engem Daten-ofhängeg MS / MS Scan gewielt.Kollisiounsenergie op 30% gesat.D'Orbitrap Resolutioun gouf op 15.000 gesat an d'AGC Zil op 100%.Déi personaliséiert maximal Injektiounszäit ass op 60 Millisekonnen gesat.
Ier Dir d'Protein-Protein-Netzwierk a vernetzte Proben verfollegt, hu mir déi réi Dateie veraarbecht mat dem MaxQuant Package (Versioun 1.6.12.0) 26,27 fir tracéierbar Peptiden / Proteinen an de Proben z'identifizéieren.Zousätzlech goufen ähnlech proteomesch Analysen op uncrosslinked Flo-1 Proben ausgefouert, déi mat IFNα behandelt an onbehandelt goufen.MS / MS Daten goufen an der UniProt Mënsch Datebank gesicht (www.uniprot.org) (eropgelueden 12. August 2020, enthält 75,093 Entréen) mat der agebauter Sichmotor Andromeda27.D'Sich gouf duerchgefouert ouni d'Spezifizitéit vum Enzym a verschidde Modifikatioune vun Deamidatioun (N, Q) an Oxidatioun (M) ze weisen.Virgänger Mass Toleranzen goufen op 20 ppm a Produktione bei 0,02 Da gesat.Déi initial a maximal Massabweichung gouf op 10 ppm gesat.Déi maximal Mass vum Peptid gouf op 4600 Da gesat an d'Sequenz Ähnlechkeet gouf tëscht 7 an 25 Aminosäuren (aa) gesat.Weider statistesch Analyse gouf mat dem Perseus Programm gesuergt (Versioun 1.6.10.45).Proteingehalt gouf berechent andeems d'Spektralintensitéit vum Protein (LFQ Intensitéit; unlabeled Quantification)27 normaliséiert gëtt an d'Intensitéitswäerter goufen op Log2 ëmgewandelt.Eng hierarchesch Clustering vu Proteinen, déi duerch hir Peptidintensitéit identifizéiert goufen, gouf mam Pheatmap (v1.0.12) Package am R (v 4.1.2) gebaut.Pathway Beräicherung Analyse gouf mat der Reactome Passerelle Datebank fir IFNα-behandelt Proteinen ausgefouert, déi méi wéi véier Mol aktivéiert waren am Verglach mat onbehandelt Proben.
Identifikatioun vu Lysin (K) oder Serin (S) spezifesch chemesch Crosslinks vu Proteinkomplexe, déi duerch LC-MS /MS iwwerwaacht goufen, gouf mat enger spektroskopescher Identifikatiounsmaschinn (SIM-XL) fir vernetzte Peptiden (SIM-XL)29 gemaach.Éischt, méiglech Interaktiounen tëscht interferon-assoziéiert (IFN) DNA Schued Resistenz Ënnerschrëft (IRDS) Genen goufen ënnersicht mat der IRDS Protein Dataset beschriwwen an Padariya et al.28.Screening vun all Konditiounen a Widderhuelunge vum ganze mënschlechen UniProt ass computationell intensiv, sou datt déi ganz mënschlech UniProt Datebank (www.uniprot.org) (12.Ee vun de Filtere fir héich Vertrauensinteraktiounen.Dës héich-Bedeitung Interaktiounen kritt goufen erweidert a getest an all Wiederholungen a Konditiounen.
Am SIM-XL gouf DSS fir den Crosslinker (XL) benotzt an d'XL Gewiichtverschiebung an d'Modifikatiounsgewiichtverschiebung goufen op 138.06 respektiv 156.07 gesat.Déi folgend Crosslinking Reaktiounsplaze ginn ugesinn: KK, KS a KN-TERM, ouni Reporterionen.Béid Virgänger a Fragment ppm goufen op 20 gesat an den Xrea-Schwell gouf op 0,15 gesat.Trypsin gouf als komplett spezifesch ugesinn, an eng High-Energy C-Trap (HCD) Fragmentéierungsmethod gouf ëmgesat.D'XCorr dynamesch DB Reduktioun Schwell an d'Mindestzuel vu Peptiden fir dynamesch DB Reduktioun goufen op 2,5 respektiv 2 gesat.Aner Parameteren sinn: Monoisotop Wahrscheinlechkeet a Peak Zoufall Cutoff, Minimum 4 AA Reschter pro Strang a maximal Strangladung, an 3 Maxima vu verpasst Spaltungen.Déi doraus resultéierend stitched 2D Kaarten goufen analyséiert an (SIM-XL) an der xQuest28 grafesch Representatioun gouf benotzt der 2D Kaarten ze bauen.Protein Crosslinks op Proteinstrukturen ginn am PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, Versioun 2.0 Schrödinger, LLC) zur Verfügung gestallt.
Proteinmodellstrukture goufen erstallt mat dem Phyre2 Server (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 mat de Prinzipien vun der Homologiemodelléierung an der Implementatioun vun der "Hidden Markov Method".Phyre2 generéiert Modellstrukture baséiert op Sequenzausrichtung mat bekannte Proteinstrukturen.Fir H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, an MDN1 Proteinen, Schabloun Strukturen 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, an 6i2665 goufen benotzt.Zousätzlech gouf d'Struktur vun AlphaFold71 MX1, UBP18 a ROBO1 och berücksichtegt.D'Proteinstruktur gouf visualiséiert mat dem BIOVIA Discovery Studio Visualizer Package (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) an dem Molecular Operating Environment Package (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Québec, Kanada).