ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Schweess Tube Fir Chemesch Industrie chemesch Komponent, De Mangel u SPECC1L féiert zu enger verstäerkter Stabilitéit vu geschleefte Gelenker a reduzéierter Ausgruewung vu kraniale neuralen Krestzellen.

Merci fir besicht Nature.com.Dir benotzt eng Browser Versioun mat limitéierter CSS Ënnerstëtzung.Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten).Zousätzlech, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, weisen mir de Site ouni Stiler a JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Schweess Tube Fir Chemesch Industrie

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ass e féierende Hiersteller dee spezialiséiert ass op Edelstahl nahtlos Päifen, helle annealéierte Réier, nahtlos opgerullt Réier etc.Fir d'Clienten ze vereinfachen, hu mir och geschweest Päifen a Réier.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.huet déi fortgeschratt Produktiouns- an Testausrüstung.Mir kënnen Är Ufuerderung ganz zefridden stellen.Geméiss dem Standard ganz strikt, hunn d'Réier déi vun eis produzéiert ëmmer eng korrekt OD- a WT-Toleranz.D'Toleranzkontroll ass strikt am Aklang mat de Produktiounsnormen.Eis Produkter sinn ëmmer zefridden mat Clienten.D'Clienten hunn eis Produkter kaaft, hu méi Gewënn erstallt.
a) OD (Äusseren Duerchmiesser): 3,18 mm bis 101,6 mm
b) WT (Wanddicke): 0,5 mm bis 20 mm
c) Längt: Laut dem Client seng Ufuerderung
d) Normen: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 etc
e) Prozess Method: ERW, EFW etc

Sliders déi dräi Artikelen pro Rutsch weisen.Benotzt d'Réck- an d'nächst Knäppercher fir duerch d'Rutschen ze réckelen, oder d'Slide Controller Knäppercher um Enn fir duerch all Rutsch ze réckelen.
D'cranial neural crest Zellen (CNCC) schloen d'embryonal neural Falten of a migréieren an d'pharyngeal Bogen, déi déi meescht vun de Midface Strukturen bilden.CNCC Dysfunktioun spillt eng wichteg Roll an der Etiologie vun orofacial Spalt, eng gemeinsam kongenital Malformatioun.Heterozygot SPECC1L Mutatiounen goufen bei Patienten mat atypeschen a syndromesche Spalten fonnt.Hei, Rapport mir verstäerkte staining vun canonical Kliewefolie junction (AJ) Komponente, β-catenin an E-cadherin zu cultured SPECC1L knockdown Zellen, an Elektronen micrographs weisen apical-basal Diffusioun vun AJ.Fir d'Roll vum SPECC1L an der kraniofacialer Morphogenese ze verstoen, hu mir e Specc1l-defizit Mausmodell erstallt.Homozygot Mutanten sinn embryonal fatal a weisen eng verschlechtert Neuralröhrschließung an CNCC Laminatioun.AJ Proteinfaarf gëtt a mutanten neuralen Falten erhéicht.Dësen AJ Defekt ass konsequent mat engem Defekt an der CNCC Delaminatioun, déi AJ Opléisung erfuerdert.Zousätzlech hunn Specc11 Mutanten d'PI3K-AKT Signaliséierung reduzéiert an d'Apoptose erhéicht.In vitro, mëll Hemmung vun PI3K-AKT Signalisatioun an Wild-Typ Zellen war genuch AJ Ännerungen ze induce.Wichteg ass, AJ Ännerungen entschlof duerch SPECC1L knockdown kann duerch Aktivatioun vun der PI3K-AKT Passerelle ëmgedréint ginn.Zesummegefaasst suggeréieren dës Donnéeën datt SPECC1L, als neie Reguléierer vun der PI3K-AKT Signaliséierung an der AJ Biologie, fir Neural Röhre Zoumaache an CNCC Stratifikatioun erfuerderlech ass.
Cranial neural Crest Zellen (CNCCs) lokaliséieren an den dorsalen Neuroectoderm an trennen sech vum Neuroepithel vun den entwéckele neuralen Falten duerch e Prozess deen den Epithel-mesenchymal Transitioun (EMT) 1,2,3 involvéiert.Premigréierend epithelial CNCCs stéieren interzelluläre Kräizungen a ginn migréierend mesenchymal CNCCs, déi den éischten an zweete Pharyngealbogen fëllen an de gréissten Deel vum kraniofaciale Knorpel bilden.Also, Genen, déi d'CNCC Funktioun regelen, ginn dacks an der Etiologie vu kraniofaciale kongenitalen Anomalien gestéiert wéi orofacial Spalten, déi meeschtens 1/800 Gebuerten an den USA eleng beaflossen.Ee vun de kongenitalen Deformatiounen8.
Delaminatioun vum CNCC fällt mat der Zoumaache vum anteriore neuralen Röhre tëscht 8.5 an 9.5 Deeg vun der embryonescher Entwécklung bei Mais.Mutanten vun enger Zuel vu Maus orofacial Spalt-assoziéiert Genen weisen och eng Form vun Neuralröhredefekt, dorënner Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 a Pdgfrα12.Wéi och ëmmer, d'Prozesser vun der Neuralröhrschließung an der CNCC Stratifikatioun kënnen als onofhängeg ugesi ginn, well d'Splotch mutant Maus (Pax3) Mängel an der Neuralröhrschließung weist ouni Effekt op d'CNCC Stratifikatioun oder Migratioun 13,14.Zousätzlech Mausmodeller mat Mängel an der CNCC-Dissektioun an der Neuralröhrschließung hëllefen d'gemeinsame molekulare Basis vun dësen zwee Prozesser ze delinéieren.
Isolatioun vun CNCC aus neuroepithelial Zellen erfuerdert d'Opléisung vu Klebstoffverbindungen (AJs), déi aus Proteinkomplexe besteet, déi ënner anerem E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, an α-Actinin mat Aktin Filamenter 2 enthalen. Iwwerexpressiounsstudien E-Cadherin an neuralen Falten weisen eng Reduktioun oder Verzögerung vun der CNCC Delaminatioun.Ëmgekéiert, Ennerdréckung vun E-cadherin Resultater an fréi stratification15,16.Vill vun de Faktoren déi EMT während der CNCC Stratifikatioun vermëttelen sinn Transkriptiounsfaktoren (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) an extrazellulär Matrix (ECM) Remodeling Proteine ​​​​wéi Matrix Metalloproteinasen (MMPs), awer CNCCs sinn direkt Zytoskeletal AJ Reguléierer. nach net bekannt.De PI3K-AKT Wee ass bekannt fir E-Cadherin Niveauen antagoniséieren, haaptsächlech vu Kriibsfuerschung17.Rezent Studien hu gewisen datt Verloscht vun der PDGFα-baséierter PI3K-AKT Signaliséierung bei Mais zu kraniofacialen Anomalie féiert, dorënner gesplécktem Gaum an Neuralröhrdefekter12.Allerdéngs ass d'Relatioun tëscht der PI3K-AKT Passerelle an AJ Stabilitéit op CNCC stratification onkloer.
Mir identifizéiert virdru SPECC1L als éischt mutant Gen an zwee Leit mat engem schwéieren Spalt, deen aus dem Mond op d'Ae geet, bekannt als Schrägspalt (ObFC) oder Tessier IV18 Spalt.SPECC1L Mutatiounen goufen an zwou multigenerational Famillen mat dem autosomal dominante Opitz G/BBB Syndrom (OMIM #145410) identifizéiert, an deem betraff Individuen Hyperdistance a Spalt Lip/Gout19 ausgestallt hunn, an an enger Famill mam Tibi Iwwerdistanz Syndrom (OMIM #145420)20 .méi wéi d'Halschent vun de Fäll vum Opitz G /BBB Syndrom sinn X-verbonne (OMIM #300000) a ginn duerch Mutatiounen am MID1 Gen verursaacht, wat de Protein 22 vum Mikrotubule-assoziéierten Zellskelett kodéiert.Mir hypothetiséieren datt SPECC1L, och e Protein assoziéiert mat Mikrotubulen an dem Actin-Zytoskelett, d'Signalisatioun erfuerderlech fir d'Aktin-Zytoskelett-Remodeling während der Zelladhäsioun a Migratioun 18 vermëttelen.Duerch in vitro an in vivo Studien, beschreiwen mir elo SPECC1L als Roman regulator vun AJ Stabilitéit duerch PI3K-AKT Signalisatioun.Um Zellniveau huet SPECC1L-Mangel zu enger Ofsenkung vum Niveau vum Pan-AKT-Protein an eng Erhéijung vun der apical-basaler Dispersioun vun AJ gefouert, déi duerch chemesch Aktivatioun vum AKT-Wee éliminéiert gouf.In vivo, Specc11-defizit Embryonen weisen beeinträchtigen Neuralröhrschließung a reduzéierter CNCC-Dissektioun.Also funktionnéiert SPECC1L an héich geregelten Zelladhäsioun-baséiert Signaliséierung erfuerderlech fir normal CNCC Funktioun wärend der Gesiichtsmorphogenese.
Fir d'Roll vun SPECC1L um bewosst Niveau ze charakteriséieren, benotzt mir déi virdru beschriwwen stabil osteosarcoma Zell Linn U2OS defizit an SPECC1L18.Dës stabil U2OS Zellen mat SPECC1L (kd) knockdown haten eng moderéiert (60-70%) Ofsenkung vun den Niveauen vun SPECC1L Transkriptiounen a Proteinen, zesumme mat Mängel an Migratioun an Reorganisatioun vun der Actin Zytoskelett 18. Am Géigesaz, eng schwéier transient Ofsenkung an SPECC1L huet gewisen, datt zu mitotic Mängel 23 féieren.Op weider characterization, hu mir festgestallt, datt eis stabil SPECC1L-kd Zellen Morphologie op engem ganz héije Mooss vun Zesummefloss geännert (Dorënner 1).Individuell Kontroll Zellen an kd Zellen um niddereg Zesummefaassung ausgesinn ähnlech (Dorënner 1A, D).24 Stonnen no Fusioun, behalen Kontroll Zellen hir cuboidal Form (Lalumi 1B, E), iwwerdeems SPECC1L-kd Zellen verlängert (Lalumi 1C, F).Den Ausmooss vun dëser Verännerung vun der Zellform gouf duerch in vivo Live Imaging vu Kontrollzellen a Kd Zellen (Film 1) ageholl.Fir d'Roll vun SPECC1L zu confluent Zellen ze bestëmmen, iwwerpréift mir éischt seng Ausdrock.Mir hunn erausfonnt datt SPECC1L Proteinniveauen op der Fusioun eropgaange sinn (Dorënner 1G), wärend SPECC1L Transkriptniveauen net eropgaange sinn (Dorënner 1H).Zousätzlech, wéi Zell Dicht fräi, SPECC1L Protein cumuléierten um intercellular Grenzen (Lalumi 2A-E), mat engem Muster mat deem vun Membran-verbonne β-catenin (Lalumi 2A'-E') iwwerlappt.Kritt der Associatioun vun SPECC1L mat der Actin Zytoskelett 18,23 mir hypothetiséiert datt SPECC1L mat actin-baséiert Kliewefolie junctions (AJ) interagéiert.
(AF) SPECC1L knockdown (DF) Zellen verlängeren bei héijer Zesummefloss (F) am Verglach mat Kontroll U2OS Zellen (AC).Hei sinn dräi vun de sechs Zäitpunkten (T1, T3, T6) déi mir fir verschidden Zelldichten ausgewielt hunn.(G) Western blot Analyse weist, datt d'SPECC1L Protein op engem héije Mooss vun Zesummefaassung am Verglach zu engem nidderegen Ofschloss vun Zesummefloss an Kontroll Zellen stabiliséiert ass.Western blot vun SPECC1L weist der erwaart 120 kDa Band an eng héich molekulare Gewiicht Band, méiglecherweis post-translationally geännert (*).Western blot Analyse war ënnert déi selwecht Konditiounen fir niddereg an héich Zesummefloss gesuergt.Biller SPECC1L um niddereg an héich Zesummefloss weisen sech aus der selwechter blot geholl.Dee selwechte Blot gouf geläscht an nei iwwerpréift mat β-Actin Antikörper.(H) Quantitativ RT-Hinnen alleguer Analyse zougedréckt keng grouss Ännerungen an SPECC1L Transkriptiouns Niveauen.Feeler Baren representéieren SEMs vu véier onofhängegen Experimenter.
(AE) Mir hunn sechs Zäitpunkte gewielt (T1-T6) déi eng Rei vun Zelldichten representéieren fir d'Zellformanalyse an d'AJ Ännerungen an U2OS Zellen mat SPECC1L Knockdown (kd) ze normaliséieren.Déi éischt fënnef vun dësen Zäitpunkte waren eenzel Zellen (T1), 50-70% Fusioun vu klengen Zellstärekéip (T2), Fusioun ouni kd Zellen (T3), reshaping kd Zellen (T4) a 24 Stonnen Ännerungen.an der posterior Form vu kd (T5) Zellen.D'SPECC1L Protein war virun allem am Zytoplasma op T1 (A) verspreet, mä seng Heefung gouf um intercellular Grenzen op spéider Zäit Punkten (B-E, Pfeile) observéiert.(FJ) β-catenin weist ähnlech Akkumulation bei interzelluläre Grenzen mat dem AJ Komplex assoziéiert.(A'-E ') SPECC1L an β-catenin weisen iwwerlappend staining um Zell Grenzen op héich Zell Dicht (Pfeiler).(F'-J') An SPECC1L-kd Zellen, schéngt β-catenin staining normal bei niddereg Zell Dicht (F'-H'), mee expandéiert wéi Zell Form Ännerungen (I', J'; Pfeile), beweist dass AJ geännert hunn.Baren = 10 µm.
Mir hunn dunn probéiert den Effet vum SPECC1L-Mangel op AJ ze bestëmmen.Mir hunn e puer AJ-assoziéiert Marker benotzt, dorënner déi kanonesch Komponenten F-Actin, Myosin IIb, β-catenin, an E-cadherin24,25,26,27.Actin Stress Faseren fräi an SPECC1L-kd Zellen wéi virdru beschriwwen (Figebam. 3A, B) 18.Myosin IIb mat actin Filamenter assoziéiert huet eng ähnlech Erhéijung vun SPECC1L-kd Zellen kënschtlech gewisen (Lalumi 3C, D).AJ-assoziéiert β-catenin bindet zu Cadherin an der Zell Membran, weist eng normal "Honeycomb" Ausdrock Muster an Kontroll cubocytes (Figebam. 3E, G).Spannen, an flaach Biller benotzt confocal microscopy, β-catenin (Lalumi 3E, F) an E-cadherin (Lalumi 3G, H) staining op der Zell Membran vun confluent SPECC1L-defizit Zellen zougedréckt prominent Mustere vun verlängert staining.Dës Expansioun vun AJ-verbonne β-catenin staining zu kd Zellen war am Zesummenhang meescht ausgeschwat, mee wossten Ännerungen an Zell Form (Lalumi 2F-J, F'-J ').Fir déi kierperlech Natur vun dëser verlängert AJ staining ze bestëmmen, iwwerpréift mir Zell Grenzen op der apical-basal Uewerfläch vun SPECC1L-kd U2OS Zellen vun Transmissioun Elektronen microscopy (TEM) (Dorënner 3I, J).Am Géigesaz zu Kontroll Zellen (Lalumi 3I), déi separat Elektronen dichten Regiounen indikativ vun AJ haten (Pfeiler), kd Zellen (Lalumi 3J) weisen grouss, kontinuéierlech Regioune vun héich Elektronen Dicht indikativ vun AJ laanscht de apicobasal Fliger..Zousätzlech, op Queeschformat Rubriken, observéiert mir extensiv Zell Membran klappt an kd Zellen (Lalumi S1A, B), déi erklärt der erweidert Muster vun β-catenin an E-cadherin staining Bands (Lalumi 3F, H).An Ënnerstëtzung vun der Roll vun SPECC1L an AJs, β-catenin war co-immunoprecipitated mat SPECC1L an lysates vun confluent U2OS Zellen (Lalumi 3K).Zesumme mat verlängert immunostaining fir AJ Marker, TEM Analyse war konsequent mat eiser Hypothes datt SPECC1L Defizit AJ apical-basal Dicht a Varianz erhéicht.
(AH) Erhéije F-Actin-Faarwen an kd Zellen bei 48 Stonnen Post-Fusioun (T6; A, B).Verännert Faarwen vu Myosin IIb verbonne mat F-Actin (C, D).Déi glat Muster vun β-catenin an E-cadherin Membran staining zu Kontroll Zellen (E, G) war zu SPECC1L-kd (F, H) Zellen verstäerkt.Baren = 10 µm.(I-J) Elektronenmikrographen déi den apikale-basale interzelluläre Kräizung observéieren.Kontrollzellen weisen ënnerscheedlech elektronendichte Regiounen, déi plakeg Kräizunge besichen (I, Pfeile).Am Géigesaz, erschéngt déi ganz apical-basal Kräizung an SPECC1L-kd Zellen Elektronendicht (J, Pfeile), wat d'Erhéijung vun der Dicht an d'Dispersioun vu Klebstoffverbindunge beweist.(K) β-catenin war co-immunoprecipitated mat SPECC1L zu confluent U2OS Zell lysates.Bild geholl vun enger Plaz representéiert ee vu véier onofhängegen Experimenter.
Fir d'Roll vun SPECC1L zu craniofacial Morphogenesis ze verstoen, hu mir e Specc1l-mangel Maus Modell mat zwou onofhängeg ES Trap Zell Linnen, DTM096 an RRH048 (BayGenomics, CA) geschaf (BayGenomics, CA), déi representéieren intron 1 an Specc1l Transkriptiounen goufen um 15 ageholl (Figebam. 1) .4A, Figur S2).D'genomesch Lag vun der decoy Vecteure Insert war duerch ganz Genom sequencing bestëmmt a vun PCR bestätegt (Figebam. S2).Béid Gen Trap Designs hunn och erlaabt In-Frame Fusioun vun de Specc11-lacZ Reporter bei der Erfaassung.Dofir, lacZ Ausdrock bestëmmt vun X-gal staining war als Luucht vun Specc11 Ausdrock benotzt.Béid Allele weisen ähnlech lacZ Ausdrock Musteren, mat der DTM096 Genfale am Intron 1 méi staark Ausdrock wéi RRH048 an Intron 15 (net gewisen).Wéi och ëmmer, Specc1l ass wäit ausgedréckt, mat besonnesch staarken Ausdrock an den neuralen Falten bei E8.5 (Figure 4B), am Neuralröhre a Gesiichtsprozesser bei E9.5 an E10.5 (Figure 4C, D), an an der Entwécklung vu Gliedmaart. op e10.5 an Aen (Dorënner 4D).Mir gemellt virdrun dass SPECC1L Ausdrock an der éischter pharyngeal Arch um E10.5 am epithelium an Basisdaten mesenchyme18 präsent war, konsequent mat der CNCC Lineage.Fir SPECC1L Ausdrock am CNCC ze testen, hu mir E8.5 neural klappt (Dorënner 4E-J) an E9.5 Schädel Sektiounen (Dorënner 4K-).Op E8.5, SPECC1L gefiermt neural klappt intensiv (Lalumi 4E, H), dorënner Zellen mat NCC lues (Lalumi 4G, J).Um E9.5, SPECC1L (Lalumi 4K, N) staark gemoolt migrating CNCC Co-faarweg mat AP2A (Lalumi 4L, M) oder SOX10 (Lalumi 4O, P).
(A) Schematesch Representatioun vun der Maus Specc11 Gen decoy Vecteure Aféierung an ES DTM096 (intron 1) an RRH048 (intron 15) Zell clones weist.(BD) lacZ staining vun heterozygot Specc1lDTM096 Embryonen representéiert Specc1l Ausdrock vun E8.5 zu E10.5.NE = neuroectoderm, NF = neural Fold, PA1 = éischte pharyngeal arch.(EP) SPECC1L Immunostaining mat NCC Markéierer AP2A an SOX10 an E8.5 (NF; EJ) neural Falten an E9.5 (KP) Schädel Sektiounen.SPECC1L staining war dicht an neural klappt E8.5 (E, H; Pfeilheads) observéiert, dorënner Zellen mat AP2A (F, G; arrowheads) an SOX10 (I, J; Pfeilheads) markéiert.Bei E9.5, SPECC1L staark gemoolt migrating CNCCs (K, N; Pfeiler) Label AP2A (L, M; Pfeiler) an SOX10 (O, P; Pfeiler).
D'Kräizung tëscht heterozygote Specc1lDTM096 /+ an Specc1lRRH048 /+ Mais weist datt déi zwee Gentrap Allele net komplementär sinn an datt zesummegesate Heterozygoten an embryonal Homozygote fir entweder Gentrap Allele embryonal fatal sinn (Table S1).Mendelian Verhältnisser uginn eng Ofsenkung vun der Iwwerliewe Taux vun heterozygotes bei Gebuert (erwaart 1,34 vs. 2,0).Mir bemierken niddereg perinatal veruerteelt ënnert heterozygotes, e puer haten craniofacial anomalies (Lalumi S3).Wéi och ëmmer, déi niddereg Pénétranz vun dësen perinatalen kraniofaciale Phänotypen mécht et schwéier hir Basisdaten pathophysiologesch Mechanismen ze studéieren.Dofir hu mir eis op den embryonale fatale Phänotyp vun homozygote Specc11 Mutanten konzentréiert.
Déi meescht Verbindungen heterozygot oder homozygot Specc1lDTM096 /RRH048 mutant Embryonen hunn net no E9.5-10.5 entwéckelt (Fig. 5A-D), an d'neural Rouer huet net anterior zougemaach (Fig. 5B, D) an heiansdo posterior zougemaach (net gewisen) ..Dëst cranial neural Rouer Zoumaache Mängel war mat der Majoritéit vun CNCC markéiert DLX2 verbleiwen an der neural klappt um E10.5 assoziéiert, keng dissection besot (Dorënner 5A'-D').Fir festzestellen, ob d'Gesamtgréisst vun CNCC och reduzéiert gouf, markéiert mir CNCC Linnen mat GFP an eiser Gentherapie Trap Linnen mat Wnt1-Cre an ROSAmTmG.Mir Baach zortéiert GFP + NCC an GFP- (RFP +) Net-NCC aus ganz Embryonen.Bei E9.5 huet den Undeel vu fluxsortéierte GFP-labeléierte CNCCs net wesentlech tëscht WT a mutanten Embryonen geännert (net gewisen), wat normal CNCC Spezifizéierung beweist.Dofir, hu mir hypothetiséiert datt Reschtoffall Wnt1-Cre an DLX2 staining an ausgesat neural klappt (Dorënner 5B ') war wéinst defekt CNCC layering, méiglecherweis wéinst fräi Dicht oder Dispersioun vun AJ Zellen, wéi an SPECC1L-kd Zellen gesinn.Mir hunn d'NCC Markéierer SOX10, AP2A, an DLX2 benotzt fir d'Präsenz vu CNCC an der neuraler Fal ze bestätegen (Dorënner 5E-R).Um E8.5, neural ausfalen staining fir all dräi NCC lues war an Rubriken vun WT (Lalumi 5E, G, ech) an Specc1l mutant (Lalumi 5F, H, J) observéiert.Bei E9.5, während NCC Markéierer gemoolt migrating NCC zu WT Rubriken (Lalumi 5M, O, Q), Reschtoffall NCC staining war an ausgesat neural Falen vun Specc1l mutant Embryone observéiert (Lalumi 5N, P, R).Well SOX10 an DLX2 migréieren CNCCs markéieren, seet dëst Resultat datt SPECC1L-defizit CNCCs post-migratoresch Spezifizéierung erreechen, awer net aus neurale Falten migréieren.
Specc11 Defizit féiert zu defekter Neuralröhrschließung, Delaminatioun vu kraniale neuralen Krestzellen an AJs.
(A, B ') E9.5 WT (A) Embryo droen migréierend kranial neural Crest Zellen (CNCC) mam Label Wnt1-Cre (A').Am Géigesaz, Specc11 mutant Embryonen weisen oppe neural Falten (B), Pfeilekappen) an CNCCs déi net migréiert hunn (B', Pfeilspëtzten).(C, D ') Bright Feld Biller (C, D') an immunostaining (C ', D') vun der CNCC Bewaacher DLX2 vun E10.5 WT Embryonen (C, C ') an Specc1l (D, D').A WT E10.5 Embryonen koloniséieren DLX2-positiv CNCC d'Gillebéi (C', Pfeile), wärend a Mutanten opfälleg Färzen an den oppenen neuralen Falten (D', Pfeile) an an den éischte Pharyngealbogen (D', Pfeile).) mat e puer staining (Pfeile) besot schlecht Delaminatioun an Migratioun vun CNCC.ER) Sektioune vu WT a Specc1l mutanten Embryonen an de Stadien E8.5 (E-L) an E9.5 (M-R) goufen mat NCC Marker SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) an DLX2 (I, J, Q, R).Op E8.5, NCC staining war an Wild-Typ neural klappt (NF) a mutant Rubriken observéiert.Co-staining vun SOX10 a β-catenin an E8.5 WT (K) a mutant (L) opgedeckt erhéicht β-catenin staining bei Zell Grenzen an der neural Falen.Op E9.5, Wild-Typ staining vun migrating CNCCs (M, O, Q) war observéiert, iwwerdeems an mutanten, unstratified CNCCs Kierchefënster oppen neural klappt (N, P, R).(S-Z) In vivo AJ Etikettéierungsanalyse a koronale Sektioune vu WT a Specc11DTM096 / RRH048 Embryonen mat der E9.5 Mutatioun.Eng geschätzte Sektiounsfläch gëtt an der ieweschter rechter Ecke gewisen.An Sektiounen vun mutant Stoffer, fräi staining vun F-actin (S, T) a myosin IIb (U, V) war observéiert.Ähnlech zu der kënschtlech Resultater an Lalumi 3, an mutant Embryonen, verstäerkte Membran staining fir β-catenin (W, X) an E-cadherin (Y, Z) observéiert gouf.(AA-BB) En Elektronenmikrograph vun engem Abschnitt vun engem Wild-Typ Embryo, deen iwwer d'Grenz vun der apikaler-Basalzell kuckt, weist eng differenzéiert elektronendicht Regioun, déi indikativ fir Klebstoffverbindungen (AA, Pfeile) weist.Am Géigesaz, a Sektioune vu Specc11 mutanten Embryonen (BB, Pfeile), ass de ganzen apicobasale Kräizung Elektronendicht, wat op eng erhéicht Dicht an Dispersioun vu Klebstoffverbindunge bezeechent.
Fir eis Hypothes ze testen datt reduzéiert Schichten wéinst verännerter AJ ass, hu mir AJ Etikettéierung an ausgesat neural Falten vun Specc1l mutanten Embryonen iwwerpréift (Fig. 5S-Z).Mir observéiert eng Erhéijung vun actin Stress Faseren (Lalumi 5S, T) an eng concomitant fräi Lokalisatioun vun myosin IIB staining op actin Faseren (Lalumi 5U, V).Wichteg, observéiert mir fräi staining vun β-catenin (Lalumi 5W, X) an E-cadherin (Lalumi 5Y, Z) um intercellular Grenzen.Mir iwwerpréift och β-catenin staining vun NCC an der neural klappt vun E8.5 Embryonen (Lalumi 5K, L).β-catenin staining schéngen méi staark ze Specc1l mutant neural klappt (Figebam. 5L an K), suggeréiert datt AJ Ännerungen ugefaangen haten.An Elektronen micrographs vun Doudekapp Rubriken vun E9.5 Embryonen, observéiert mir erëm diffusen Elektronen-dichte staining zu Specc1l mutant Embryonen am Verglach zu WT (Lalumi 5AA, BB an S1E-H).Zesummegefaasst ënnerstëtzen dës Resultater eis in vitro Resultater an SPECC1L-kd U2OS Zellen a proposéiere datt aberrant AJ-Faarwen d'CNCC-Stratifikatioun an eise mutanten Embryonen viraus.
Kritt der bekannt antagonistic Relatioun tëscht AKT Aktivitéit an E-cadherin Stabilitéit, 17,28 mir hypothesized d'Bedeelegung vun PI3K-AKT sécher.Zousätzlech hu mir subepidermal Bléiserung an e puer vun eise mutanten Embryonen observéiert, déi d'Letalitéit (<5%) bei E9.5-10.5 entkomm sinn an amplaz sech ëm E13.5 niddergelooss hunn (Fig. S3).Subepidermal Vesikel sinn e Markenzeeche vu reduzéierter PI3K-AKT Signaliséierung baséiert op PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) huet gemellt datt d'Stéierung vun der PDGFRα-baséierter PI3K Aktivatioun an PdgfraPI3K / PI3K mutanten Embryonen zu subepidermale Vesikel, Neuralröhredefekter a Phänotypen vun der Spaltgaum resultéiert.Tatsächlech, Niveau vun Pan-AKT an aktiv phosphorylated Ser473-AKT sech zu VIVO an Specc1l mutant Stoffer zu E9.5 embryonal verhaft reduzéiert (Lalumi 6A-D).D'Ofsenkung vun Niveau vun phosphorylated Ser473-AKT kann ganz wéinst der Ofsenkung vun Niveau vun Pan-AKT zu VIVO VerfÜgung (Lalumi 6E) an kënschtlech VerfÜgung (Lalumi 6F).Eng kënschtlech Ofsenkung gouf nëmmen observéiert wann U2OS Zellen staark konfluent waren mat Verännerungen an der Zellform an der AJ Dicht (Dorënner 6D).Also, eis Donnéeën hindeit datt SPECC1L e Roman positive regulator vun PI3K-AKT Signal an craniofacial morphogenesis ass.
(A-E) E8.5 (A, B) an E9.5 (C, D) Schädel Sektiounen oder E9.5 lysates aus Specc1l mutant Embryonen (E) weist Niveauen vun aktiv phosphorylated S473-AKT a Pan-AKT Protein Reduktioun , Verglach mat Kontroll WT.Western blotting war op Wild-Typ lysates a mutant lysates ënner déi selwecht Konditiounen gesuergt.D'Biller fir SPECC1L gewisen goufen aus engem blot geholl.Dee selwechte Blot gouf geläscht an nei iwwerpréift mat Anti-Pan-ACT a β-Actin Antikörper.Pan-AKT Niveauen an E8.5 neural klappt (A, B) an Niveauen vun phosphorylated S473-AKT an E9.5 Schädel Rubriken sech bedeitend reduzéiert.(F) Pan-AKT Niveauen goufen ähnlech reduzéiert an lysates vun SPECC1L-kd U2OS Zellen um héich Zesummebroch recoltéiert.Feeler Baren representéieren SEMs aus dräi onofhängeg Western blot quantifications.(GJ) Rubriken vun WT Embryonen um E9.5 Kierchefënster mat KI67 a gekleet caspase 3, respektiv, weist Zell Prolifératioun (G, G ') a wéineg apoptotic Aktivitéit (H, H').Specc11 mutant Embryonen weisen vergläichbar Zellproliferatioun (I), awer d'Zuel vun den Zellen, déi Apoptose erliewen, ass wesentlech erhéicht (J).
Mir iwwerpréift dann Marker vun Verbreedung an apoptosis.Mir hunn keen Ënnerscheed an der Verbreedung vun E9.5 Embryonen (Lalumi 6E, G am Verglach zu ech) mat enger Prolifératioun Index vun 82,5% fir WT mutants an 86,5% fir Specc1l mutants gemooss vun KI67 staining (p VerfÜgung & Si besteet; 0,56, Fisher d'observéiert). genee Test).Ähnlech hu mir keen Ënnerscheed an der Apoptose beobachtet, gemooss duerch d'Faarwen fir gekierzt Caspase 3 an neuralen Falten bei E8.5 bis Embryoverhaftung (net gewisen) (net gewisen).Am Géigesaz, war apoptosis wesentlech an all E9.5 mutant Embryone fräi (Lalumi 6F, H an J).Dës Gesamterhéigung vun der Apoptose ass konsequent mat reduzéierter PI3K-AKT Signaliséierung a fréi embryonaler Lethalitéit29,30,31.
Als nächst, fir eng kausal Roll fir PI3K-AKT Signaliséierung an AJ Ännerungen an eiser kd Zellen ze bestätegen, hu mir chemesch de Wee an der Kontroll a kd Zellen geännert (Dorënner 7A-F).Mir hunn als Marker d'Zellform änneren Phänotyp benotzt an konfluenten SPECC1L-kd Zellen observéiert, déi mir quantifizéiert hunn mat dem Verhältnis vun der längster Dimensioun (Längt) zu der entspriechender vertikaler Dimensioun (Breet).E Verhältnis vun 1 gëtt erwaart fir relativ ronn oder kuboidal Zellen (Dorënner 7G).Nieft Zell Form, confirméiert mir och den Effet op AJ vun β-catenin staining (Lalumi 7A'-F).Inhibition vun der PI3K-AKT Passerelle benotzt wortmannin war genuch Zell Form zu Kontroll Zellen ze änneren (Dorënner 7A, C) an AJ (Dorënner 7A ').PI3K-AKT activator SC-79 beaflosst net Zell Form (Lalumi 7A, E) oder AJ Expansioun (Lalumi 7A ') an Kontroll Zellen.An SPECC1L-kd Zellen, weider Ennerdréckung vun der PI3K-AKT Passerelle zu fräi apoptosis (Lalumi 7B, D) an eng däitlech Erhéijung vun β-catenin staining (Lalumi 7B '), konsequent mat eisem zu VIVO schwéier mutants.Wichteg ass, Aktivatioun vun der PI3K-AKT Passerelle vill verbessert Zell Form (Dorënner 7B, F) an AJ phenotypes (Dorënner 7B").Ännerungen an Zell Form sech als Zell roundness Verhältnis (CCR) quantifizéiert a fir Bedeitung Verglach wéi uewen beschriwwen (Fig. 7G).Tatsächlech, an Kontroll Zellen (Figebam. 7G, CCR = 1.56), wortmannin Behandlung war genuch der Zell Form wesentlech ze änneren (Lalumi 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) zu der Mooss ähnlech zu der eent observéiert. an SPECC1L.-kd Zellen (Figebam. 7G, CCR = 3,46).Wortmannin Behandlung vun SPECC1L-kd Zellen (Lalumi 7G, CCR = 3,60, vernoléissegt) war net méi bedeitend wéi onbehandelt kd Zellen (Lalumi 7G, CCR = 3,46, negligible) oder wortmannin-behandelt Kontroll Zellen (Lalumi. 7G)., CCR = 3,46, vernoléissegt) beaflosst zousätzlech Zellelongatioun (7G, CCR = 3,61, vernoléissegt).Wichtegst, restauréiert SC-79 AKT activator der verlängerten phenotype vun SPECC1L-kd Zellen (Lalumi 7G, CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Dës Resultater bestätegen datt SPECC1L PI3K-AKT Signaler reguléiert a proposéiere datt eng moderéiert Ofsenkung vun SPECC1L Zell Adhäsioun beaflosst, während e staarken Ofsenkung zu Apoptose féiert (Figebam. 8).
(A–F') Kontroll (A, C, E) an SPECC1L-kd (B, D, F) Zellen behandelt mat PI3K-AKT Wee Inhibitor Wortmannin (C, D) oder SC-79 Aktivator (E, F) Behandlung .Untreated Kontroll Zellen sinn cuboidal (A) mat normal β-cat cellular staining (A '), iwwerdeems kd Zellen sinn verlängert (B) mat verstäerkte β-cat staining (B').No Ennerdréckung vun der PI3K-AKT Passerelle, Kontroll Zellen verlängert (C) mat β-Kat Expansioun (C '), iwwerdeems kd Zellen ugefaang apoptosis (D), ähnlech zu eis héich mutated Embryonen an extrem verstäerkte β-Katze weisen.Färzen (D').No Aktivatioun vun der PI3K-AKT Passerelle, Kontroll Zellen bliwwen cuboidal (E) an haten normal β-Katze (E ') staining, iwwerdeems kd Zellen weisen bedeitend verbessert Zell Form (F) an β-cat (F') staining, besot. (G) De Grad vun der Zellformännerung an (AF) gouf quantifizéiert mat der Zellronnheetsverhältnis (CCR) vun der längster Dimensioun (Längt) an der entspriechender vertikaler Dimensioun (Breet) mat MetaMorph Software.Onbehandelt (NT) SPECC1L-kd Zellen (CCR = 3,46) ware wesentlech méi laang wéi Kontrollzellen (CCR = 1,56, p <6,1 × 10-13).Wort d'inhibition vun der PI3K-AKT Passerelle zu Kontroll Zellen war genuch eng ähnlech elongation zu Zell Form ze féieren (CCR = 3.61, p VerfÜgung & Si besteet; 2.4 × 10-9).Ähnlech, AKT Aktivatioun vun SC-79 an SPECC1L-kd Zellen restauréiert Zell elongation zu Kontroll Niveauen (CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Wortmannin Behandlung vun SPECC1L-kd Zellen doraus zu fräi apoptosis awer keng weider Erhéijung vun Zell Form änneren (CCR = 3.60) am Verglach zu onbehandelt kd (CCR = 3.46, ns) oder wortmannin-behandelt Kontroll Zellen (3.61) observéiert an.ns = ass egal.+/- SEM Miessunge fir 50 Zellen ginn gewisen.Statistesch Differenzen sech mat Student d'T-Test berechent.
(A) Schematesch Representatioun vun der Hemmung an der Aktivatioun vum PI3K-AKT Wee, deen zu AJ Verännerungen a Rettung resultéiert, respektiv.(B) Proposéiert Modell fir AKT Protein Stabiliséierung vun SPECC1L.
Premigratory CNCCs erfuerderen AJ Lysis fir vun anterior neural Falten neuroepithelial Zellen1,15,32 ze trennen.Erhéije Faarf vun AJ Komponenten a Verloscht vun der apical-basaler AJ asymmetrescher Verdeelung an SPECC1L-defiziten Zellen souwuel in vitro wéi och in vivo, kombinéiert mat der kierperlecher Proximitéit vu SPECC1L zu β-catenin, suggeréiert datt SPECC1L funktionnéiert fir AJ lokal Stabilitéit fir richteg z'erhalen. Organisatioun Muskelen.Actin Zytoskelett.D'Associatioun vu SPECC1L mam Actin Zytoskelett a β-catenin an d'Erhéijung vun der Unzuel vun kondenséierten Aktin Filamenter an der Verontreiung vu SPECC1L ass konsequent mat der observéierter Erhéijung vun der AJ Dicht.Eng aner Méiglechkeet ass datt eng erhéicht Zuel vun Aktinfaseren an SPECC1L-mangel Zellen zu enger Verännerung vun der interzellulärer Spannung féiert.Well de celluläre Stress d'AJ 33 Dynamik beaflosst, kënnen d'Spannungsännerungen zu méi diffusen AJ 34 féieren.Also all Ännerungen beaflossen d'CNCC Schichten.
Wnt1 gëtt an de fréie neuralen Falten ausgedréckt, déi zu neurale Krestzellen entstoen.Also, Wnt1-cre Lineage Tracing markéiert souwuel Pre- a Migratioun NCC35.Wéi och ëmmer, Wnt1 markéiert och dorsale Gehirngewebe Klonen, déi och aus fréien neuralen Falten 35,36 ofgeleet ginn, wat et méiglech mécht datt eis Faarf vun E9.5 Mutanten fir Wnt1 Markéierer an oppenen neuralen Falten net CNCC ass.Eis positiv Faarf fir d'NCC Markéierer AP2A an SOX10 bestätegt datt déi ausgesat neural Falten vun Specc11 mutant Embryonen tatsächlech CNCC enthalen.Zousätzlech, well AP2A an SOX10 Markéierer vun fréi migrating NCC sinn, positiv staining uginn, datt dës Zellen Post-migratory CNCC sinn, datt net vun E9.5 stratified ginn.
Eis Donnéeën hindeit datt molekulare Regulatioun vun AJ vun SPECC1L vun PI3K-AKT Signal vermëttelt ass.AKT Signaliséierung gëtt an SPECC1L-mangel Zellen a Stoffer reduzéiert.Befunde vum Fantauzzo et al.Ënnerstëtzt eng direkt Roll fir PI3K-AKT Signaliséierung an der kraniofacialer Morphogenese.(2014) huet gewisen datt de Mangel un Aktivatioun vu PDGFRα-baséierter PI3K-AKT Signaliséierung zu engem Spaltphänotyp féiert.Mir weisen och datt d'Inhibitioun vum PI3K-AKT Wee genuch ass fir AJ an Zellform an U2OS Zellen z'änneren.Konsequent mat eisen Erkenntnisser, Cain et al.37 huet gewisen, datt d'Downregulatioun vun der PI3K α110 Ënnerunitéit an Endothelzellen zu enger ähnlecher Erhéijung vun der pericellularer β-catenin-Faarf resultéiert, déi als Erhéijung vum "Konnektivitéitsindex" bezeechent gëtt.Allerdéngs, an endothelial Zellen hir actin Filamenter schonn héich organiséiert, Ennerdréckung vun der PI3K-AKT Passerelle Resultater zu enger loose Zell Form.Am Géigesaz, weisen SPECC1L-kd U2OS Zellen eng verlängert Zell Form.Dësen Ënnerscheed kann Zelltyp spezifesch sinn.Wärend Ënnerdréckung vun der PI3K-AKT-Signaliséierung dauernd den Aktin-Zytoskelett beaflosst, gëtt den Effekt op d'Zellform duerch Verännerungen an der Spannung bestëmmt, déi duerch Verännerungen an der Dicht an der Organisatioun vun den zentrale Aktinfaseren verursaacht ginn.An U2OS Zellen, hu mir nëmmen Zell Form Ännerungen als Marker vun SPECC1L-mangel AJ änneren an Erhuelung benotzt.Als Conclusioun, hypotheséiere mir datt d'Inhibitioun vum AKT-Wee am SPECC1L-Mangel d'AJ Stabilitéit erhéicht an d'Delaminatioun am CNCC reduzéiert.
Interessanterweis goufen Pan-AKT Niveauen kënschtlech an VIVO reduzéiert, nieft phosphoryléierten 473-AKT Niveauen an der Verontreiung vu SPECC1L, suggeréiert d'Reguléierung vu PI3K-AKT Signalisatioun um Niveau vun der AKT Proteinstabilitéit oder Ëmsaz.D'SPECC1L an MID1 Genen, souwuel mat Opitz /GBBB Syndrom assoziéiert, codéieren Proteinen déi Mikrotubulen 18,22 stabiliséieren.De Mechanismus, duerch deen SPECC1L a MID1 d'Mikrotubulestabiliséierung vermëttelen ass net voll verstanen.Am Fall vun SPECC1L enthält dës Stabiliséierung eng verstäerkte Acetylatioun vun engem Ënnerdeel vu Mikrotubulen 18.Et ass méiglech datt SPECC1L en ähnleche Mechanismus benotzt fir aner Proteinen wéi AKT ze stabiliséieren.Et gouf gewisen datt Acetylatioun vu Lysinreschter am AKT Protein zu enger Ofsenkung vun der Membranlokaliséierung a Phosphorylatioun38 féiert.Zousätzlech ass d'Ubiquitinatioun vun der K63 Kette am selwechte Lysinreschter op AKT erfuerderlech fir seng Membranlokaliséierung an Aktivatioun39,40.Ënnert e puer Faktoren, déi mat SPECC1L Proteinen interagéieren, identifizéiert a verschiddene High-Duergang Hef zwee-Hybrid Schiirme, véier - CCDC841, ECM2942, APC an UBE2I43 - goufen an Protein Ëmsaz oder Stabilitéit iwwer Ubiquitinatioun oder Sumoylation implizéiert.SPECC1L kann an der post-translational Modifikatioun vun AKT Lysin Reschter Équipe ginn, AKT Stabilitéit Afloss.Allerdéngs bleift d'kritesch Roll vun SPECC1L an der Lokalisatioun a Stabilitéit vun der AKT FAQ opgekläert ginn.
Schwéier Mängel am SPECC1L Ausdrock zu VIVO gefouert zu verstäerkte AJ Marker staining a defekt CNCC Iwwerlagerung, souwéi fräi apoptosis a fréi embryonal lethality.Virdrun Berichter hu gewisen datt Mausmutanten mat verstäerkten Niveauen vun der Apoptose mat Neuralröhredefekte 44,45,46,47 a kraniofacial Defekte48 verbonne sinn.Et gouf virgeschloen datt exzessiv Zell Doud an den neuralen Falten oder pharyngeal Bogen zu enger net genuch Zuel vun Zellen resultéiere kënnen, déi fir eng korrekt morphogenetesch Bewegung 48,49,50 erfuerderlech sinn.Am Géigesaz, eis SPECC1L defiziter Zell Linnen mat mëttelméisseg reduzéiert SPECC1L Ausdrock weisen nëmmen AJ Ännerungen ouni Beweis vun fräi Zell Doud.Wéi och ëmmer, chemesch Inhibitioun vum PI3K-AKT Wee an dëse Kd Zellen huet zu enger verstäerkter Apoptose resultéiert.Sou, suergt eng moderéiert Ofsenkung vun SPECC1L Ausdrock oder Funktioun Zell Iwwerliewe.Dëst ass konsequent mat der Observatioun datt seelen Specc11 mutant Embryonen déi verhaft bei St.E9.5 - vläicht wéinst reduzéierter Genfangeffizienz - kënnen hir Neuralröhren zoumaachen a spéider an der Entwécklung stoppen, dacks mat kraniofaciale Mängel (Fig. S3).Och konsequent mat dësem ass déi selten Optriede vun heterozygote Specc1l Embryonen mat kraniofaciale Abnormalitéiten - wahrscheinlech wéinst verstäerkter Genfangeffizienz - wéi och d'Entdeckung an Zebrafësch, an deem ee vun den zwee SPECC1L Orthologen (specc1lb) spéiden embryonal Phänotypen verursaacht, dorënner Verloscht vun ënnescht Kieper a bilateral Spalten51.Also, heterozygot SPECC1L Verloscht vu Funktioun Mutatiounen, déi a mënschleche Patienten identifizéiert goufen, kënne kleng Behënnerungen an der SPECC1L Funktioun während der kraniofacialer Morphogenese verursaachen, genuch fir hir orofacial Spalten z'erklären.SPECC1L-baséiert Reguléierung vun interzelluläre Kontakter kann och eng Roll bei der Palatogenese a Fusioun vun de Pharyngealbogen spillen.Weider Studien vun der SPECC1L Funktioun wäerten hëllefen d'Roll vun temporäre interzelluläre Kontakter am CNCC wärend der Neuralröhrschließung an der neuroepithelialer Zellmotilitéit an der kraniofacialer Morphogenese z'erklären.
U2OS Osteosarcoma Kontroll a SPECC1L-kd Zellen goufen virdru beschriwwen (Saadi et al., 2011).Antikörper géint SPECC1L goufen och virdru charakteriséiert (Saadi et al., 2011).Anti-β-catenin Antikörper (Kanéngchen; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (Maus; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Kalifornien), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), gespléckt Caspase 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) an β-Actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) gouf benotzt wéi beschriwwen..Actin Filamenter goufen mat Acti-Stain Rhodamine phalloidin (Cytoskelett, Denver, Colorado) gefierft.
U2OS Kontroll Zellen an SPECC1L-kd Zellen sech am Standard héich Glukos DMEM kultivéiert mat 10% Fetal Bovine serum (Life Technologies, Karlsbad, CA).Fir AJ Ännerungen, goufen 2 x 105 Zellen op Glas mat 0,1% porcine gelatin behandelt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) gesaat a fir Ännerungen an Zell Form observéiert.Zelle goufen op verschidden uginn Zäitpunkte gesammelt: 4 Stonnen no Aussaat (t = 1), 24 Stonnen no Aussaat (t = 2), Zesummefloss ouni Ännerung vun Zell Form (t = 3), Ännerung vun Zell Form (t = 4) , 24 h no Zell Form änneren (t = 5) an 48 h no Zell Form änneren (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Fir de PI3K-AKT Wee ze moduléieren, goufen d'Zellen an den uginnene Konzentratioune mat dem PI3K-AKT-Inhibitor Wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) oder SC-79 Aktivator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota) kultivéiert.D'Medium mat de Chemikalien gouf all Dag geännert.
Frame-by-Frame Opzeechnunge goufen op Live Kontroll a KD Zellen ënner normale Kulturbedéngungen gemaach, a Phasekontrastbilder goufen all 10 Minutte fir 7 Deeg gesammelt.D'Biller goufen mat engem computerkontrolléierte Leica DM IRB Inverted Mikroskop mat enger mechanescher Bühn an engem 10 × N-PLAN Objektiv mat enger QImaging Retiga-SRV Kamera verbonnen.Wärend der Imaging goufen Zellkulturen bei 37 ° C an enger fiichter Atmosphär mat 5% CO2 gehal.
Zwee Gen Trap ES Zell Linnen DTM096 an RRH048 aus der Regional Mutant Mouse Ressource Center (UC Davis, CA) goufen benotzt Specc11 defizit Maus Linnen ze generéieren, bezeechent Specc1lgtDTM096 an Specc1lgtRRH046.Kuerz, goufen 129 /REJ ES Zellen an C57BL6 blastocysts injizéiert.Déi doraus resultéierend chimeric männlech Mais goufen mat weiblech C57BL6 Mais geziicht fir Nofolger mat agouti Mantel Faarf z'identifizéieren.D'Präsenz vu Gentrap Vecteure Inserts gouf benotzt fir Heterozygoten z'identifizéieren.Mais goufen op engem gemëschten Hannergrond vun 129 / REJ; C57BL6 gehal.D'Plaz vun der Insertiounsplaz vum genetesche Fallvektor gouf duerch RT-Hinnen alleguer bestätegt, Genom Sequenzéierung a genetesch Ergänzung (Ergänzungsbild 1).Fir d'CNCC Lineage vun duebele heterozygote Specc1lGT Mais ze verfolgen, goufen ROSAmTmG (# 007576) a Wnt1-Cre (# 003829) Mais (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) gekräizt fir de ROSAmTmG a Wnt1-Cre Allel am Speccyol ze produzéieren.All Experimenter an Mais goufen no Protokoller vun der Institutional Animal Care and Use Committee vun der University of Kansas Medical Center guttgeheescht.
Embryoen goufen fixéiert (1% Formaldehyd, 0,2% Glutaraldehyd, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mm EGTA) fir 60 min bei Raumtemperatur.No Fixatioun an X-gal staining Léisung (5 mM KaliumiodidPëlle ferricyanide, 5 mM KaliumiodidPëlle ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0,01% Natrium deoxycholate, 0,02% NP-40, 1 mg /ml X-gal) stain Entwécklung war bei 37 ° C gesuergt. .°C bannent 1-6 Stonnen.Embryoen goufen postfixéiert a 4% PFA a visualiséiert.
Fir Western blotting, goufen Zellen an passiv lysis Prellbock (Promega, Fitchburg, WI) mat enger Mëschung vun HALT protease inhibitors ergänzt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) lysed.Lysates goufen op 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX fäerdeg Gelen (Bio-Rad, Hercules, CA) veraarbecht an op Immobilon PVDF Membranen (EMD Millipore, Billerica, MA) transferéiert.D'Membranen goufen an 5% Mëllech an PBS blockéiert mat 0,1% Tween.Antikörper goufen iwwer Nuecht bei 4 ° C oder fir eng Stonn bei Raumtemperatur inkubéiert.Femto SuperSignal West ECL reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA) war fir Signal Generatioun benotzt.Fir immunostaining, Embryone goufen iwwer Nuecht an 4% PFA /PBS fixéiert an cryopreserved.Tissue Cryosections goufen an PBS blockéiert mat 1% normale Geessserum (Thermo Scientific, Waltham, MA) an 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) an duerno bei 4 ° C an engem Inkubator während der Inkubator inkubéiert. Nuecht.mat Anti-Antikörper a fluoreszenter Secondaire Antikörper (1:1000) fir 1 Stonn bei 4 ° C.Stained Rubriken goufen an ProLong Gold mëttelfristeg gesat (Thermo Scientific, Waltham MA) a flaach Biller sech mat engem Leica TCS SPE confocal microscope kritt.All immunostaining war als dräi onofhängeg Experimenter op cirossections vun op d'mannst zwee mutant Embryone gesuergt.E representativt Experiment gëtt gewisen.
Zellen goufen am modifizéierten RIPA Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% Glycerol, 2 mM EDTA, an HALT Protease-Inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) inkubéiert. Kuerz, goufen lysates prepurified mat Protein G Magnéitfeld Perlen (Life Technologies, Carlsbad, CA) an dann iwwer Nuecht incubated bei 4 ° C. mat Anti-SPECC1L oder IgG Protein G Protein Perlen goufen benotzt SPECC1L ze Extrait a Western blotting war mat der Anti gesuergt. -β-catenin antibody uewen beschriwwen D'Co-IP Experimenter gewisen si representativ fir véier onofhängeg Experimenter.
Fixed cultured Zellen oder Maus embryonal Stoffer goufen dem Elektronenmikroskopie Zentrum op der University of Kansas Medical Center geliwwert.Kuerz gesot, Proben goufen am EMbed 812 Harz (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA) agebonnen, iwwer Nuecht bei 60 ° C polymeriséiert, a bei 80 nm gedeelt mat engem Leica UC7 Ultramikrotome ausgestatt mat engem Diamantblade.Sektioune goufen visualiséiert mat engem JEOL JEM-1400 Transmissiounselektronenmikroskop ausgestatt mat enger 100 kV Lab6 Pistoul.
Wéi zitéiert dësen Artikel: Wilson, NR et al.Defizit vu SPECC1L féiert zu enger verstäerkter Stabilitéit vu geschleefte Gelenker a reduzéierter Delaminatioun vu kraniale neuralen Krestzellen.d'Wëssenschaft.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induktioun an Differenzéierung vum neuralen Kamm.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Cranial neural Crest Zellen a Bewegung: hir Roll an der kraniofacial Entwécklung.American Journal of Medical Genetics.Part A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurokristopathia: säi Wuesstum an d'Entwécklung iwwer 20 Joer.Kannerdokter.Pathologie.Labo.Medizin.Eng., 17, 1–25 (1997).
Mangold E, Ludwig KU, Noten MM.Trends in Molecular Medicine 17, 725-733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. a Riley, FM Molekulare Mechanismen vun der kranialer neuraler Crestzellmigratioun a Musterung während der kraniofacial Entwécklung.Entwécklung 137, 2605-2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH, Murray, JK.natierlech Commentaire.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Abnormal Morphogenese vun der Haut, Glidder a kraniofaciale Regioun an Interferon-reguléierende Faktor-6 (Irf6) -defizite Mais.National Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Dominant Mutatiounen am GRHL3 verursaachen de Van der Waord Syndrom a behënnert d'Entwécklung vum mëndlechen Periderm.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ a Juriloff, DM Update d'Lëscht vun de Mausmutanten mat Mängel an der Neuralröhrschließung a Fortschrëtter Richtung e komplette genetesche Verständnis vun der Neuralröhreschließung.Enquête vun Gebuert Mängel.Deel A, Clinical and Molecular Teratology 88, 653-669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-mediéiert PDGFRalpha Signaliséierung regelt d'Iwwerliewe an d'Proliferatioun an der Skelettentwécklung duerch e p53-ofhängegen intrazelluläre Wee.Gene Entwécklung 28, 1005-1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND a Murdoch, JN.Trends an der Neurologie.26, 453-455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).