310 10 * 1mm Edelstahl opgerullt Réier chemesch Komponent, D'N-terminal Domaine vu Spidroin bilden Hydrogelen baséiert op Amyloid Fibrillen a bidden eng Plattform fir Protein Immobiliséierung.

Merci fir besicht Nature.com.Dir benotzt eng Browser Versioun mat limitéierter CSS Ënnerstëtzung.Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten).Zousätzlech, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, weisen mir de Site ouni Stiler a JavaScript.
Sliders déi dräi Artikelen pro Rutsch weisen.Benotzt d'Réck- an d'nächst Knäppercher fir duerch d'Rutschen ze réckelen, oder d'Slide Controller Knäppercher um Enn fir duerch all Rutsch ze réckelen.

Spezifizéierung

310 10 * 1mm STAINLESS Stol coiled tubing Fournisseuren

Chemesch Zesummesetzung

Mechanesch Eegeschafte

Rekombinant Spann Seid Proteinen (Spann Seid Proteinen) hu vill potenziell Uwendungen an der Entwécklung vun neie Biomaterialien, awer hir multimodal a aggregéiert Natur mécht se schwéier ze kréien an einfach ze benotzen.Hei mellen mir datt rekombinant Miniatur Spidroin Proteinen an, Wichteg, den N-terminal Domain (NT) selwer séier selbststänneg an transparent Hydrogelen bei 37 ° C bilden.Fusiounsproteine ​​besteet aus NT a gréngen fluoreszenter Protein oder Purinnukleosidphosphorylase bilden voll funktionell Fusiounsproteine.Hydrogels.Eis Resultater weisen datt rekombinant NT a Fusiounsproteine ​​​​héigen Ausdrocksausgaben ubidden an Hydrogelen mat attraktiven Eegeschafte wéi Transparenz, Geléierung ouni Crosslinking an direkt Immobiliséierung vun aktive Proteinen mat héijer Dicht dotéieren.
Spannen hu sou vill wéi siwe verschidde Sätz vu Seiddrüsen, déi all eng spezifesch Seidtyp produzéieren.All siwe Seid Arten besteet aus Spann Seid Proteinen (Spidroins) ongeféier 6000 Reschter laang an enthalen eng grouss zentrale Widderhuelung Regioun ëmgi vu kugelfërmeg N- an C-terminal Beräicher (NT an CT)1,2.Déi meescht studéiert Aart vu Seid, déi primär Ampulla, gëtt vun der primärer Ampulla Drüs produzéiert.An dëser Drüs synthetiséiert eng Monoschicht vun Epithelzellen Spidroin-Proteine ​​a sekretéiert se an de Lumen vun der Drüs, wou se an enger löslecher Form (Doping) bei extrem héijer Konzentratioune (30-50% w/v)3,4 präsent sinn.D'Organisatioun an d'Konformatioun vun den Haapt-ampullare Spidroin-Proteinen an der Drüs ass diskutéiert ginn, awer déi meescht experimentell Beweiser weisen op d'Präsenz vun enger allgemeng helical an / oder zoufälleg helical Konformatioun a micellar oder lamellar Strukturen5,6,7,8,9,10.Wärend déi repetitive Domänen mechanesch Eegeschafte vu Seidfaser reguléieren, bilden β-Blat Nanokristallen an amorph Strukturen11,12,13,14,15, Enddomaine reguléieren Seidfaseren als Äntwert op verännert Bedéngungen laanscht d'Seiddrüs16,17,18.Duerch d'Kontroll vu Seidbildung, 19. Terminal Domänen sinn evolutiv konservéiert an hir Funktioun ka fir all Spidroin Proteinen 2,20,21 gemeinsam sinn.Wärend der Passage duerch d'Drüse fällt de pH vum Spidroin vun ongeféier 7,6 op < 5,716 erof a erhéicht mat Schéier a Stretch vermëttelt duerch Bewegung duerch de graduell verengt Kanal.An der Léisung ass CT en α-helikal konstitutiv parallelen Dimer17, awer als Äntwert op nidderegen pH a Schéierkraaft, CT entfalten a wiesselt β-Layer16, 17, méiglecherweis β-Schichten an de repetitive Regioune vun Convert 16. NT si monomer ënner. Bedéngungen, déi Bedéngungen am Lumen vun der Drüs reflektéieren an d'Léisbarkeet vu Spidroin vermëttelen, awer bei reduzéierter pH féiert d'Protonatioun vun enger Zuel vu Carboxylsäure-Säitketten zu Dimeriséierung vum NT mat enger pKa vun ongeféier 6,5, doduerch stabiliséiert NT a fixéiert Spidroin am groussen Quantitéiten.Netzwierker 16,18.Also spillt NT eng Schlësselroll an der Filamentbildung, ännert sech vun engem Monomer an der Beschichtung op en Dimer an der Faser23,24,25.NT bleift héich soluble an helical ënner all Konditiounen bis date studéiert16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, déi seng Entwécklung als solubility-verbesserende Label fir d'Produktioun vun heterologe Proteinen inspiréiert.
Rekombinant Mini Spann Seid Protein, besteet aus engem NT, enger kuerzer Widderhuelungsregioun, engem CT, an engem His6 Tag (His-NT2RepCT) fir d'Rengung, ass sou löslech am Waasserbuffer wéi gebierteg Spann Seid Protein a mimict gebierteg wichteg Charakteristiken vu Seid Spann. .Ofdeckung 25.31.His-NT2RepCT kann a kontinuéierleche Faseren gesponnen ginn mat enger biomimetescher Maschinn, an där eng pH 8 löslech Beschichtung an e pH 525,32,33,34,35 Waasserbad extrudéiert gëtt.Bioreaktor Fermentatioun vun E. coli ausdréckend His-NT2RepCT a spéider Postbehandlung huet zu> 14 g /L Ausbezuele no der Reinigung gefouert.Déi héich Ausbezuelung, héich Solubilitéit an adäquat Äntwert vu His-NT2RepCT op sauer Bedéngungen ginn all un NT23, 25, 34 zougeschriwwen.
Hei bericht mir déi séier Bildung vun transparenten Hydrogelen aus rekombinante Spidroin Proteinen, dorënner NT eleng, andeems eng Proteinléisung bei 37 ° C inkubéiert gëtt.Mat Thioflavin T Fluoreszenz (ThT), Fourier Transform Infrarout Spektroskopie (FTIR), Nuklear Magnéitesch Resonanz Spektroskopie (NMR) an Transmissioun Elektronen Mikroskopie (TEM), hu mir festgestallt datt NT a Mikrospider Proteine ​​​​strukturell Transformatioun an β-Placken an amyloidähnleche Fibrillen erliewen. wann Gele geformt ginn.Zousätzlech, Fusioun Proteinen vun NT a gréng fluorescent Protein (GFP) oder Purin Nukleosid phosphorylase (PNP) Form Hydrogels mat voll funktionell Fusioun Fragmenter.High-Throughput Ausdrock an heterologen Hosten, gekoppelt mat enger schneller Bildung vun Hydrogelen ënner physiologeschen Bedéngungen, mécht d'Méiglechkeet op eng kosteneffektiv Produktioun vun Hydrogelen mat manipuléierte Funktiounen op.
Am Géigesaz zu de meeschte gemellt rekombinante Spidroin Proteinen36, His-NT2RepCT ass stabil am Tris-HCl Puffer bei pH 8 a ka bis zu 500 mg / ml ouni Nidderschlag konzentréiert ginn25.Dofir ware mir iwwerrascht ze fannen datt dëst Protein séier optesch kloer, selbststänneg Hydrogelen bilden wann se bei 37 ° C inkubéiert ginn (Figebam. 1b-d).Weider Studien weisen datt His-NT2RepCT Gelatioun iwwer eng breet Palette vu Proteinkonzentratioune geschitt ass (10-300 mg /ml) an datt dës Konzentratioun ëmgedréint mat der Geléierungszäit korreléiert gouf (Figebam. 1c an Zousaz Lalumi 1).Fir erauszefannen wéi eng Deeler vu His-NT2RepCT d'Hydrogelbildung vermëttelen, iwwerpréift mir dann all Domain individuell a a verschiddene Kombinatioune mat enger Kolbensinversiounsassay (Dorënner 1a, b).All getest Fraktiounen vun rekombinant spidroin geformt gels (bei enger Protein Konzentratioun vun 300 mg / ml) a manner wéi 1 h, ausser fir ausgefalene 2Rep (Fig. 1b).Dëst hindeit datt NT an CT eleng, a Kombinatioun, oder assoziéiert mat Widderhuelungen, bei 37 ° C geléiere kënnen an datt d'His6-Tag dëse Prozess net zu engem wesentlechen Ausmooss beaflosst.Mat der gemeinsamer Notioun datt NT en héichlöslechen a stabile Protein ass, an datt fréier Berichter vu rekombinante Spidroin-Hydrogelen Geléierungseffekter u konformational Ännerungen an widderhuelende Regiounen an / oder CTs zougeschriwwen hunn, kéint NT selwer.D'Entdeckung vun der Geléierung war onerwaart.Zousaz Table 1) 37, 38, 39. Bemierkenswäert, NT scho gelled bannent 10 Minutten bei enger Konzentratioun vun ≥ 300 mg / ml (Fig. 1c).Vial Inversioun Experimenter mat verschiddene Konzentratioune vun NT gewisen, datt bei> 50 MG /ml der NT Léisung méi séier gelled wéi His-NT2RepCT bei der entspriechend Konzentratioun (w /v, Dorënner 1c).
Schematesch Representatioun vu verschiddene Spidroinkonstruktiounen, déi an dëser Aarbecht studéiert ginn.b Gel Zäit bei 37 ° C fir verschidde rekombinant Spidroin Proteinen (300 mg / ml) verifizéiert duerch d'Invertéierung vun der Fläsch.CT Gel direkt ouni Inkubatioun (<300 mg/ml), 2Rep Ausfäll (300 mg/ml, 5 mm Skala).c Gel Zäit vun His-NT2RepCT an NT bei uginn Protein Konzentratioune bei 37 ° C.d Fotoe vu His-NT2RepCT an NT Hydrogelen mat der Spann an dem Bréif "NT" drënner gedréckt respektiv (béid 200 mg / ml, Skala Bar 5 mm).
Hydrogels, déi vu verschiddene rekombinante Spidroin Proteine ​​​​geformt sinn, hunn liicht ënnerschiddlech Faarwen, an d'Observatioun vu bloussem A weist ënnerschiddlech Grad vun Transparenz (Fig. 1b).NT Gele sinn aussergewéinlech kloer, während aner Gele opak ginn.Seng-NT2RepCT an NT gels Goss an zylindresch Réier konnt aus der Ofdréck intakt geläscht ginn (Fig. 1d).
Fir ze testen, ob natierlech Spann Seidbeschichtungen geléieren ënner Bedéngungen, déi elo fonnt gi fir Geléierung vun de rekombinante Spidroin Proteinen ze verursaachen, goufen Beschichtungen aus der grousser Ampulla Drüs vun der schwedescher Bréckspinn (Larinioides sclopetarius) gesammelt.Beschichtungen goufen an 20 mM Tris-HCl Puffer bei 50 mg /ml (baséiert op gemoossene trockenem Gewiicht) gespäichert, awer keng Gelatioun gouf während der 21 Deeg Inkubatioun bei 37 ° C (Ergänzungsbild 2a) observéiert.
Fir dës Gelen ze quantifizéieren, kënne rheologesch Miessunge benotzt ginn fir de Geléierungsprozess ze studéieren an déi allgemeng mechanesch Eegeschaften ze bestëmmen.Besonnesch d'Iwwerwaachung vum Lagermodul (Elastizitéit) bei erhiewten Temperaturen kann Informatioun iwwer d'Geléierungstemperatur wéi och d'viskoelastesch Eegeschafte vun der Beschichtung liwweren.Temperaturerhéijungsexperimenter (benotzt 1 ° C / min bei 25-45 ° C, baséiert op fréiere Studien mat natierleche Seidstockléisungen) 40,41 huet gewisen datt d'Späichermodul vu His-NT2RepCT an NT Léisunge mat der Erhéijung vun der Temperatur eropgaange sinn.gouf erhéicht (Fig. 2 an Ergänzungsbild 3).Notamment huet den NT Modul ugefaang bei enger méi niddereger Temperatur am Verglach zum His-NT2RepCT ze wuessen, konsequent mat der méi séier Gelzäit observéiert wann NT direkt mat His-NT2RepCT bei 37 ° C inkubéiert gouf (Dorënner 1).No enger spéider Ofsenkung vun der Temperatur ass de Späichermodul net op méi niddereg Wäerter zréckkomm a blouf iwwer dem Verlustmodulus (kuckt Ergänzungsbild 3), wat thermesch irreversibel stabil Geléierung bezeechent.No der Geléierung ass de finalen elastesche Modul vu 15 bis 330 kPa fir His-NT2RepCT Hydrogelen bei enger Konzentratioun vun 100-500 mg / ml, an de finalen elastesche Modul fir NT Hydrogelen (100-500 mg / ml) variéiere vun 2 bis 1400 kPa (Figebam, 2 a komplett Rampendaten) gesinn Zousaz Lalumi 3).
a Ännerung vun der Temperatur während Miessunge vun His-NT2RepCT (300 mg / ml) a b NT (300 mg / ml) mat shaking.D'Pfeile weisen den Temperaturtrend un, an déi méi hell Schiet vun de Späichermoduldaten beschreiwen Tester mat méi nidderegen Dréimomentwäerter fir d'Instrument wéi vum Hiersteller spezifizéiert, wat d'Ursaach vum verstäerkte Kaméidi ass.c Enn-Modul Heefung vun His-NT2RepCT an NT no erhiewt Temperatur (100, 300, an 500 mg /ml).All Modullesunge gi mat enger Frequenz vun 0,1 Hz geholl.
Als potenziell Method fir konformational Ännerunge mat Gelatioun z'ënnersichen, hu mir FTIR Spektre vu His-NT2RepCT an NT virun an no Gelatioun bei 37 ° C opgeholl (Dorënner 3a, b).Wéi erwaart hunn d'Spektre vu His-NT2RepCT an NT Léisunge mat Proteinen entspriechen, déi α-Helikus / zoufälleg Spule sekundär Struktur weisen, mat enger ausgeprägter Band op 1645 cm-1.Fir béid Hydrogelen huet d'Gelatioun zu der Bildung vun zwee Waffen an der Mëtt I Band bei ongeféier 1617 cm-1 an 1695 cm-1 (Fig. 3a, b) gefouert, wat d'Bildung vun antiparallellen β-Blatstrukturen besot.Dës Ännerungen kënnen och kloer an der jeweileger zweeter Derivat an Differenzgelatiounsspektre gesi ginn (Ergänzlech Fig. 4b).Déi zwou Bands vun der NT β-Layer ware méi ausgeschwat wéi déi vun His-NT2RepCT, wat beweist datt den Gesamtgehalt vun β-Layer Bands am NT Hydrogel méi héich war wéi dee vum NT2RepCT Hydrogel.
e FTIR Absorptiounsspektre vu His-NT2RepCT a b NT (béid 500 mg / ml) virun (Léisung) an no (gel) Inkubatioun bei 37 ° C.c TEM Biller vun resuspendéiert 50 mg / ml NT2RepCT Gelen an d NT.Skala Bar 200 nm.e Fiber Duerchmiesser vu His-NT2RepCT an NT Hydrogelen.n = 100 gemoossene Fibrillen, p < 0,0001.D'Feelerbaren weisen d'Standardabweichung.Den Zentrum vun de Feeler Baren ass d'Moyenne.En unpaired T-Test (zwee-tailed) gouf fir statistesch Analyse benotzt.f ThT Fluoreszenz vu verschiddene rekombinante Spidroin Proteinen (100 mg / ml) bei 37 ° C ouni ze schüttelen.g NT (100 mg / ml) Impfungsexperimenter aus 100 mg / ml NT Gel mat 0%, 5%, 10% an 20% Somen.
Analyse vum Gel mat Hëllef vun Transmissiounselektronenmikroskopie (TEM) huet gewisen datt den Hydrogel aus Amyloidähnleche Fibrillen (Fig. 3c, 3d) besteet.NT-geformt Fibrillen goufen verlängert (5-12 nm Duerchmiesser) an onverbranchéiert, während His-NT2RepCT Fibrillen méi kuerz an der Längt waren a wesentlech méi breed am Duerchmiesser (7-16 nm) (Figebam. 3e).Dës Resultater hunn eis erlaabt d'Kinetik vun der Fibrose mat der Thioflavin T (ThT) Assay ze verfollegen.Fir all rekombinant Spidroin Proteinen, huet de fluorescent Signal eropgaang wann Echantillon bei 37 ° C incubated goufen (Figebam. 3f, Zousaz Lalumi 5a).Konsequent mat dëser Entdeckung, huet d'mikroskopesch Untersuchung vun NT a His-NT2RepCT ënner Geléierungsbedéngungen eng eenheetlech Erhéijung vun der ThT-Fluoreszenz opgedeckt ouni bemierkbar lokal Akkumulation vun ThT-positiven Aggregaten (Ergänzlech Fig. 5b, c).D'Bildung vun ThT-positiven Fibrillen war net begleet vun enger Erhéijung vun der NT an der His-NTCT Turbiditéit (Ergänzlech Fig. 5d), dat heescht datt e Netz vu Fibrillen am Gel bilden kéint ouni d'Gel Kloerheet ze kompromittéieren.Seeden andeems se kleng Quantitéite vu virgeformte Fibrillen derbäisetzen kënnen d'Fibrilbildung vun e puer Amyloiden42,43,44 wesentlech beschleunegen, awer 5%, 10% oder 20% (w/w) NT zu enger Léisung vun NT Hydrokoagulanten derbäi.Aussaat Effekt (Fig. 3g).Vläicht ass dëst wéinst der Tatsaach, datt d'Fibrillen am Hydrogel relativ fix sinn a kënnen net als Somen benotzt ginn.
Dat onerwaart Verhalen vu rekombinante Spidroinproteine ​​bei héijen Temperaturen huet weider Nuklearmagnetesch Resonanz (NMR) Spektroskopiestudien gefuerdert fir konformational Verännerungen ze identifizéieren, déi mat Gelbildung verbonne sinn.NMR Spektrum vu His-NT2RepCT Léisungen, déi iwwer Zäit bei 37 ° C opgeholl goufen, weisen datt CT nach deelweis gefaltet war, wärend NT an 2Rep Signaler verschwonnen waren (Figebam. 4a), suggeréiert datt et haaptsächlech NT an 2Rep war déi deelweis kontrolléiert Bildung vu His- NT2RepCT Hydrogel.D'CT-Signal gouf och op 20% vu senger ursprénglecher Intensitéit ofgeschwächt, wat suggeréiert datt CT och meeschtens fixéiert an an d'Hydrogelstruktur agebaut ass.Fir e méi klengen Deel vum CT, deen esou mobil ass wéi an der preinkubéierter Probe an doduerch duerch Léisung NMR observéiert gëtt, feelen d'Spektre Signaler fir déi éischt 10 strukturéiert Reschter, méiglecherweis wéinst schwiereger Immobiliséierung vum befestegten Deel vu His-NT2Rep.D'NMR Spektrum vun der -State vun Hydrogels -NT2RepCT verroden déi predominant Präsenz vun α-Helices an β-Schichten an, zu engem manner Mooss, der zoufälleg coil Konformatioun (Figebam. 4b).Chemesch Verréckelungsanalyse vu Methioninreschter, déi nëmmen am NT präsent waren, huet gewisen datt dëst Domain an eng β-Blatstruktur ëmgewandelt gouf.D'Zäit-ofhängeg Spektrum vun NT zu Léisung huet eng eenheetlech Ofsenkung vun Signal Intensitéit (Lalumi 4c), an zolidd-Staat NMR vun NT hydrogels gewisen, datt déi meescht vun der NT Reschter zu β-Blat Strukturen ëmgerechent goufen (Lalumi 4d).D'Konformatioun vum 2Rep konnt net separat bestëmmt ginn wéinst senger Tendenz ze aggregéieren.Wéi och ëmmer, de festen Zoustand NMR Spektrum vun der NTCT a His-NT2RepCT Hydrogelen ausgesinn ganz ähnlech (Figebam. 4b; Ergänzlech Lalumi 6b), suggeréiert datt 2Rep wéineg zum strukturellen Deel vum His-NT2RepCT Hydrogel bäigedroen huet.Fir CT-Hydrogelen, α-Heliken, β-Placken, a zoufälleg helical sekundär Strukturen goufen fonnt (Ergänzlech Fig. 6d).Dëst hindeit datt e puer Deeler vum CT α-Helice bleiwen, anerer ginn β-Blieder.Also, d'Resultater vun der NMR Spektroskopie suggeréieren datt NT wichteg ass fir d'Hydrogelbildung an och transforméiert an eng β-Blat Konformatioun bei der Fusioun mat 2Rep an CT.Konsequent mat dësem, hu mir viru kuerzem festgestallt, datt amyloid raimlech Zipper méiglecherweis an alle fënnef Helices vum NT-Domain bilden, an de Waltz-Algorithmus huet eng amyloidogen Regioun an der Helix 1 virausgesot (Fig. 4e).
2D Spektrum vun 15N-HSQC 10 mg /ml His-NT2RepCT Léisung virun (blo) an 19 Stonnen no der Inkubatioun (rout) bei 37 ° C.Individuell Kräiz Peaks am roude Spektrum an F24, G136, polyA am bloe Spektrum sinn duerch eenzel Bréif Aminosaier Symboler a Rescht Zuelen bezeechent.D'Insets weisen d'Ofhängegkeet vun der Signalintensitéit op Zäit fir ausgewielte Reschter aus den NT, 2Rep, an CT Domainen.b Solid-State Radiofrequenz (RFDR) Spektrum vu His-NT2RepCT Hydrogelen.Korrelatioune vu Cα / Cβ Reschter observéiert an RFDR Spektra goufen am Verglach mat chemesche Modeller Peptid Verännerungen a Wäerter ofgeleet aus Statistiken82,83 an hire sekundäre Strukturen festgeluegt.SSB - rotativ Säiteband.c One-zweedimensional Spektrum vun 15N-HSQC 10 mg /ml NT Léisung während Inkubatioun bei 37 ° C fir 36 Stonnen.Den Inset weist volumetresch Intensitéit versus Zäit.d Solid State RFDR Spektrum vun NT Hydrogelen.D'Korrelatioune vu Cα /Cβ Reschter an hir sekundär Strukturen, déi an de RFDR Spektre observéiert ginn, ginn uginn.e Baséiert op der NT45.79 Fibrillatioun propensity Profil vun der Zipper Datebank (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).D'Rosetta Energie vun der raimlecher Blëtzverschiebungsfenster vum Hexapeptid gëtt a kcal / mol gewisen.Roude Baren bezeechnen Hexapeptide mat enger héijer Fibrose Propensitéit (Rosetta Energie ënner -23 kcal / mol; ënner der gestippter Linn).Gréng Baren weisen Fragmenter mat Rosetta Energien iwwer der Schwell un an dofir manner wahrscheinlech fir steresch Zipper ze bilden.Fragmenter mat Proline goufen aus der Analyse ausgeschloss (ouni Sailen).Quadrate weisen Gebidder vun der Amyloidose virausgesot vum Waltz Algorithmus81 (https://waltz.switchlab.org).D'Sequenz vun Aminosäurereschter vum NT ass uewen, an d'Aarte vu Reschter, déi an der β sekundärer Struktur fonnt goufen (bestëmmt duerch Feststoff NMR Spektroskopie) ginn a rout gewisen.D'Positioune vun de fënnef NT α-Helice ginn als (H1-H5)28 bezeechent.
Beim pH <6,5 dimeriséiert HT, resistent géint Hëtzt- oder urea-induzéiert Denaturatioun18.Fir ze klären wéi d'NT-Dimeriséierung a Stabilitéit d'Gelatioun beaflossen, goufen Léisunge mat 100 mg / ml NT bei pH 8, 7 a 6 kontrolléiert mat der Vial Inversion Test.NT Echantillon incubated um pH 8 a 7 gelled no 30 min bei 37 ° C, mä de pH 8 gelies blouf kloer, iwwerdeems de pH 7 gelies eng siichtbar Nidderschlag gewisen (Lalumi 5a).Am Géigesaz, eng Léisung mat HT um pH 6 huet kee Gel geformt, an e grousse Nidderschlag konnt no 20 min bei 37 ° C gesi ginn.Dëst hindeit datt d'Dimer selwer an / oder hir méi héich Stabilitéit am Verglach zu Monomeren Geléierung verhënneren.D'Bildung vun engem Nidderschlag fir NT bei pH 7 a 6 war net erwaart, well et gemellt gouf datt NT löslech ass bei 200 mg/ml27, liicht no der Hëtztdenaturatioun erëmfëllt, an och en α-Heliks bei méi nidderegen Wäerter behält. pH 18. Eng méiglech Erklärung fir dës Differenzen ass datt déi virdru gemellt Experimenter bei Raumtemperatur oder ënner, oder bei relativ nidderegen Proteinkonzentratiounen16,18,19 duerchgefouert goufen.
NT Vial Inversion Test (100 mg / ml) bei pH 8, 7, 6 an 154 mM NaCl (pH 8) no Inkubatioun bei 37 ° C.b NT CD Spektre mat an ouni 154 mM NaF respektiv 154 mM NaCl.Molar Elliptizitéit bei 222 nm gëtt an en Undeel vun natierleche Falten ëmgewandelt.c NT Inversion Assay (100 mg /ml) NT* (37 °C an 60 °C), NTA72R (37 °C), an His-NT-L6 (37 °C an 60 °C).d CD Spektra vun NT Mutanten NT*, NTA72R a His-NT-L6.Molar Elliptizitéit bei 222 nm gëtt an en Undeel vun natierleche Falten ëmgewandelt.e Inversionstest vun NTFlSp, NTMiSp a reduzéierter NTMiSp (100 mg/ml).Skala Bar 5 mm.f CD Spektre vun NT, NTFlSp, NTMiSp a reduzéiert NTMiSp.Molar Elliptizitéit bei 222 nm gëtt an en Undeel vun natierleche Falten ëmgewandelt.Voll NT Spektre bei 25 °C an 95 °C ginn an der Zousazbild 8 gewisen.
Physiologesch Salzkonzentratioun bestëmmt elektrostatesch Interaktiounen tëscht NT Ënnerunitéiten an Dimeriséierung vum NT Transfert op nidderegen pH18.Mir hu festgestallt, datt d'Präsenz vun 154 mM NaCl an NaF jo gelation inhibit huet, respektiv (Lalumi 5a, b; Zousaz Lalumi 2b) an datt dës Salzer d'thermesch Stabilitéit vun NT monomers erhéicht (Lalumi 5b, Zousaz Lalumi 8). .Et suggeréiert och datt d'Stabilitéitsverbesserung, anstatt d'Dimeriséierung, d'Gelbildung verhënnert.
Fir d'Roll vun der Proteindimeriséierung a Stabilitéit an der Geléierung weider ze entdecken, hu mir zwee Mutanten benotzt, NT * an NTA72R, déi och monomer bei nidderegen pH28.30 bleiwen.NT* ass en Duebelladungsreversalmutant an deem déi anscheinend dipolare Ladungsverdeelung vum Monomer ofgeplatt ass, wat d'Dimeriséierung verhënnert an d'Monomerstabilitéit drastesch erhéicht.NTA72R ass e geluedenen Dipol, awer Arg-substituéiert Ala ass op der Dimer Grenz lokaliséiert, sou datt Mutatiounen interferéieren mat Ënnerunitéit Interaktiounen déi fir Dimeriséierung erfuerderlech sinn.Bei der Inkubatioun bei 37 ° C huet NT * keng Hydrogel geformt, während NTA72R en opaken Gel fir 15 min geformt (Fig. 5c).Well souwuel NT * an NTA72R kann net dimerize mee ënnerscheeden an monomer Stabilitéit (Figebam. 5d), dës Resultater proposéiere staark datt héich thermodynamesch Stabilitéit NT verhënnert aus gelling.Dëst gëtt och ënnerstëtzt vun der Tatsaach, datt HT* e Gel bildt wann et bei héijer Temperatur onbestänneg ass (no 8 min bei 60°C; Fig. 5c).Et gouf virdru gewisen datt den héijen Inhalt vu Methionin am NT seng natierlech Klappung flësseg mécht an datt sechs Met zu Leu Ersatzspiller (hei als His-NT-L6 bezeechent ginn) den NT46 Monomer staark stabiliséieren.Baséierend op der Virgab datt strukturell Flexibilitéit fir NT Gelbildung erfuerderlech ass, hu mir festgestallt datt de His-NT-L6 stabile Mutant net bei 37 ° C geléiert huet (Dorënner 5c, d).Wéi och ëmmer, huet His-NT-L6 och e Gel op der Inkubatioun bei 60 ° C fir 60 min geformt (Fig. 5c).
D'Kapazitéit vum NT fir an β-Blatstrukturen ze transforméieren an Hydrogelen ze bilden schéngt op e puer awer net all NT-Domänen vum Spidroin ze gëllen.NTs vu verschiddenen Seidenarten a Spannerarten, Trichonephila clavipes (NTFlSp), geformt Gelen trotz hirem relativ nidderegen Methioningehalt an héijer thermescher Stabilitéit (Fig. 5e, f an Ergänzungstabell 2).Am Géigesaz, NT aus dem klengen ampullere Protein Spidroin vum Araneus ventricosus (NTMiSp) mat gerénger thermescher Stabilitéit an héijer Methionin-Inhalt huet keng Hydrogelen geformt (Ergänzungstabelle 2 a Fig. 5e, f).Déi lescht kann mat der Präsenz vun intramolekuläre Disulfidbindungen verbonne sinn29,47.Konsequent, wann d'Disulfidbindunge vun NTMiSp reduzéiert goufen, huet et e Hydrogel geformt no der Inkubatioun bei 37 ° C fir 10 min (Fig. 5e).Als Conclusioun sollt et feststellen datt strukturell Flexibilitéit e wichtege, awer net deen eenzege Critère fir d'Bildung vun engem Gel aus NT ass.En anere Faktor, dee relevant ka sinn, ass d'Propensitéit fir Amyloidfibrillen ze bilden, an d'Analyse mat der Zipper-Datebank an dem Waltz-Algorithmus huet eng Korrelatioun tëscht der Fäegkeet fir Gelen ze bilden an der Präsenz vun amyloidogene Regiounen, souwéi dem Ausmooss vun de virausgesote Regiounen. fir steresch Zipper ze bilden.Et war eng Korrelatioun (Ergänzungstabelle 2 an Ergänzungsbild 9).
D'Kapazitéit vum NT fir Fibrillen ze bilden an Gelen ënner gënschtege Konditiounen ze bilden huet eis zu Hypothese gefouert datt NT Fusioune mat anere Proteinfragmenter nach ëmmer Gele mat voller Funktioun vu Fusiounspartner bilden.Fir dëst ze testen, hu mir gréng fluoreszent Protein (GFP) a Purin Nukleosidphosphorylase (PNP) um C-Terminus vum NT agefouert, respektiv.Déi doraus resultéierend Fusioun Proteinen sech an E. coli mat ganz héich Finale nozeginn ausgedréckt (150 MG / L an 256 MG / L Shake flask Kulturen fir His-NT-GFP a His-NT-PNP, respektiv), konsequent mat deem wat gewisen gouf. fir Aner Proteinen fusionéiert zu NT Ref.30. His-NT-GFP (300mg /ml) a His-NT-PNP (100mg /ml) Fusiounsproteine ​​geformt Gelen no 2 Stonnen a 6,5 ​​Stonnen bei 37 ° C an, Wichteg, d'GFP Fraktioun blouf onverännert.no gelation observéiert, mat> 70% vun der initial fluorescence Intensitéit no gelation Rescht (Lalumi 6a).Fir PNP Aktivitéit a sengem-NT-PNP Léisungen a Gelen ze moossen, hu mir d'Fusiounsprotein mat NT verdünnt, well d'enzymatesch Aktivitéit vun der purer Virbereedung ausserhalb vun der Detektiounsberäich vun der Assay bei gelling Konzentratioune war.De Gel geformt mat enger Mëschung mat 0,01 mg /ml His-NT-PNP an 100 mg /ml NT behalen 65% vun der initialer enzymatescher Aktivitéit vun de preincubéierte Proben (Figebam. 6b).De Gel blouf während der Messung intakt (Ergänzungsbild 10).
eng Relativ Fluoreszenzintensitéit virun an no der Geléierung vu His-NT-GFP (300 mg / ml) an ëmgedréint Fläsch mat His-NT-GFP Hydrogel (300 mg / ml) ënner sichtbar an UV Liicht.Punkte weisen individuell Miessunge (n = 3), Feeler Baren weisen Standarddeviatioun.Den Duerchschnëttswäert gëtt an der Mëtt vun de Fehlerbalken ugewisen.b PNP Aktivitéit war vun fluorometric Analyse mat Léisungen an gels kritt aus NT (100 MG /ml) an eng Mëschung mat 0,01 MG /ml seng-NT-PNP an 100 MG /ml New Taiwan Dollar.Den Inset weist eng ëmgedréint Fläsch mat engem Hydrogel mat His-NT-PNP (5 mm Skala Bar).
Hei mellen mir d'Bildung vun Hydrogelen aus NT an aner rekombinant Spidroinproteine ​​​​vun enger Proteinléisung bei 37 ° C inkubéieren (Dorënner 1).Mir weisen datt d'Gelatioun mat der Transformatioun vun α-Helicen an β-Schichten an der Bildung vun amyloidähnleche Fibrillen assoziéiert ass (Fig. 3 a 4).Dës Entdeckung ass iwwerraschend well NTs opgerullt kugelfërmeg Fënnefhelix-Bündel sinn bekannt fir hir extrem héich Solubilitéit an héich Stabilitéit bei Konzentratioune>200 mg / ml bei 4 ° C fir e puer Deeg27.Zousätzlech, NTs liicht refolden no Hëtzt Denaturatioun bei niddereg Protein Konzentratioune am µM.Laut eise Resultater erfuerdert d'Fibrilbildung eng Kombinatioun vun> 10 mg / ml Proteinkonzentratioun a liicht erhéiert Temperatur (Fig. 1).Dëst ass konsequent mat der Iddi datt Amyloid Fibrillen aus globulär geklappte Proteine ​​kënne bilden, déi an engem deelweis entfaltenen Zoustand sinn wéinst thermesche Schwankungen ënner physiologesche Bedéngungen 48 .Beispiller vu Proteinen déi dës Konversioun ënnerhuelen enthalen Insulin49,50, β2-Mikroglobulin, Transthyretin a Lysozym51,52,53.Obwuel NT eng α-Helikus a sengem gebierteg Staat ass, ass ongeféier 65% vun der polypeptide Kette kompatibel mat steric Zipper Formatioun (Fig. 4e) 45.Zënter datt de Monomer dynamesch mobil46 ass, kann et dës potenziell amyloidogen Regiounen bei mëttelméisseg erhéigen Temperaturen aussetzen a bei héije Konzentratioune vum Gesamtprotein kann eng kritesch Konzentratioun fir Amyloidfibrilbildung erreechen54.No dësem Begrënnung hu mir eng negativ Korrelatioun tëscht Spidroin Konzentratioun a Geléierungszäit fonnt (Fig. 1c), a wann d'monomer NT Konformatioun entweder duerch Mutatiounen (NT*, His-NT-L6) oder duerch Salzzousaz stabiliséiert gëtt, kann d'Verhënnerung verhënneren Formatioun hydrogels (Fig. 5).
An deene meeschte Fäll verschwannen Amyloidfibrillen aus der Léisung als Nidderschlag, awer ënner bestëmmte Konditioune kënne se Hydrogelen bilden55,56,57.Hydrogel-formende Fibrillen hunn typesch en héijen Aspekt Verhältnis a bilden stabil dreidimensional Netzwierker duerch molekulare Entanglement, 55,58 konsequent mat eise Resultater.Fir d'Hydrogelbildung in vitro ginn d'Proteine ​​​​oft ganz oder deelweis entfalten, zum Beispill duerch Belaaschtung vun organesche Léisungsmëttel, héich Temperatur (70-90 ° C) an / oder niddereg pH (1.5-3.0) 59,60,61,62.D'Spidroin-Hydrogelen, déi hei beschriwwe ginn, erfuerderen keng haart Veraarbechtung, a si erfuerderen och keng Cross-linking Agenten fir d'Hydrogelen ze stabiliséieren.
Et gouf virdru gemellt datt Spidroin Widderhuelungen a QDs, déi schéngen β-Sheet-Switching während Seidspinn ze maachen, Hydrogelen bilden.Am Verglach zu eise Erkenntnisser waren d'Inkubatiounszäiten an / oder d'Inkubatiounstemperature wesentlech méi laang oder méi héich, respektiv, an déi resultéierend Hydrogelen waren dacks opak (Dorënner 7 an Ergänzungstabell 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Zousätzlech zu schnelle Gelenzäiten hunn NT Hydrogelen> 300 mg / ml (30%) all aner beschriwwe rekombinant Spann Seid Protein Hydrogels iwwerholl, wéi och natierlech Hydrogelen wéi Gelatine, Alginat (2%), Agar (0,5% ) a Kollagen.(0,6%) (Dorënner 7 an Zousaz Dëscher 1 an 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
D'Gelzäit an d'Elastizitéitsmodul vun den Hydrogelen an dëser Etude goufen mat anere Spidroin-baséiert Hydrogelen a gewielte natierleche Hydrogelen verglach.Referenze ginn zesumme mat enger Beschreiwung vun de Geléierungsbedingungen uginn.APS Ammoniumpersulfat, Raumtemperatur.Daten 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Spannen schéngen Weeër entwéckelt ze hunn fir ze vermeiden datt Spidroin während der Lagerung geléiert.Trotz der héijer Konzentratioun vu Protein an der Seiddrüse bedeit déi grouss Widderhuelungsregioun, déi mam terminale Domain ass, datt d'scheinbar Konzentratioun vun NT an CT an der Drüs ongeféier 10-20 mg / ml entsprécht, op der Grenz vun dëser Etude.néideg fir in vitro observéiert Hydrogel Bildung.Ausserdeem hunn ähnlech Konzentratioune vu Salze 16 NT stabiliséiert, wéi an Seiddrüsen (Fig. 5b).NT Konformatioun gouf am E. coli Zytosol studéiert a fonnt méi enk gefaltet wéi wann se in vitro iwwerpréift ginn, wat weider beweist datt Salz oder aner Faktoren seng Aggregatioun in vivo verhënneren.Allerdéngs kann d'Fähegkeet vun NTs zu β-Blat fibrils ze transforméieren wichteg fir Filamentbildung sinn a soll an zukünfteg Studien ënnersicht ginn.
Zousätzlech zu de Roman Aspekter vun NT-amyloid-wëll fibril an hydrogel Formatioun an dëser Etude observéiert, mir weisen och, datt dëst Phänomen biotechnologesch a biomedizinesch Uwendungen hunn kann (Figebam. 8).Als Beweis vum Konzept hu mir NT mat GFP oder PNP kombinéiert a gewisen datt d'Fusiounsprotein och Hydrogelen bilden wann se bei 37 ° C inkubéiert sinn an datt d'GFP an PNP Fraktiounen haaptsächlech hir Aktivitéit no der Geléierung behalen (Dorënner 6).Nukleosidphosphorylase si wichteg Katalysatoren Synthese vun Nukleosidanalogen75, wat eis Entdeckung relevant fir d'biopharmazeutesch Industrie mécht.D'Konzept fir Fusiounsproteine ​​auszedrécken, déi transparent Hydrogelen ënner gënschtege Bedéngungen bilden, erlaabt d'Schafung vu funktionaliséierte Hydrogelen mat favorabele Properties fir eng breet Palette vun Uwendungen wéi Enzym Immobiliséierung, kontrolléiert Medikamentverëffentlechung an Tissue Engineering.Zousätzlech sinn NT an NT * effizient Ausdrockmarker30, dat heescht datt NT a seng Varianten fir High-Throughput-Produktioun vu lösleche Fusiounsproteine ​​​​an der spéider Kreatioun vun immobiliséierte Zilproteinen an 3D Hydrogelen benotzt kënne ginn.
NT ass löslech, α-helikal a stabil bei niddrege Konzentratioune (µM) an 37 ° C.Bei der selwechter Temperatur, awer bei erhéijen Konzentratioune (> 10 mg / ml), NT bildt Gele besteet aus amyloidähnleche Fibrillen.NT Fusiounsproteine ​​bilden och fibrillar Gele mat voll funktionnelle Fusiounsfragmenter, wat et erlaabt verschidde Proteinen an 3D Hydrogelen mat NT ze immobiliséieren.Ënnen: NT (PDB: 4FBS) an Illustratiounen vun Léngen Netzwierker an assoziéiert Protein Strukturen (ugeholl an net op Skala gezeechent, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210 / pdb2B3Q / pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210 / pdb4RJ).
D'Konstruktiounen (kuckt Ergänzungstabell 4 fir eng komplett Lëscht mat Aminosäuresequenzen) goufen an de Plasmid pT7 gekloont an an E. coli BL21 (DE3) transforméiert.E. coli enthale manipuléierte Plasmiden goufen an Luria Bouillon inokuléiert, ergänzt mat Kanamycin (70 mg /l) an iwwer Nuecht bei 30 ° C an 250 RPM gewuess.D'Kultur gouf dunn 1/100 an LB Medium mat Kanamycin inokuléiert a bei 30 ° C an 110 RPM kultivéiert bis den OD600 0,8 erreecht huet.Fir NMR Studien, goufen Bakterien am M9 minimal Medium ugebaut mat 2 g D-Glukose 13C (Aldrich) an 1 g Ammoniumchlorid 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) fir Protein Etikettéierung mat Isotopen.Senk d'Temperatur op 20 Grad Celsius an induzéieren Protein Ausdrock mat 0,15 mM Isopropylthiogalactopyranoside (endlech Konzentratioun).No Iwwernuechtung Protein Ausdrock, Zellen sech bei 7278 × g, 4 ° C fir 20 min recoltéiert.Zellpellets goufen an 20 mM Tris-HCl, pH 8, resuspendéiert a bis weider Benotzung gefruer.Thawed Zellen goufen mat enger Zell disruptor (TS Serie Maschinnen, Constant Systems Limited, England) bei 30 kPa lysed.Duerno goufen d'Lysate bei 25.000 g fir 30 Minutten bei 4 ° C centrifugéiert.Fir NTMiSp gouf de Pellet dann an 2 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8, resuspendéiert a fir 2 min (2 s on/off, 65%) sonicated, dann erëm bei 25.000 xg, 4 ° C. bannent centrifugéiert. 30 min.De Supernatant gouf op eng Ni-NTA Kolonn gelueden, mat 20 mM Tris-HCl, 2 mM Imidazol, pH 8 gewäsch, a schliisslech gouf de Protein mat 20 mM Tris-HCl, 200 mM Imidazol, pH 8 eluéiert. Fir NT2RepCT ze generéieren an NTCT, Thrombin Verdauung féiert de Site (ThrCleav) tëscht His an NT.Thrombin Spaltplazen sinn och präsent an His-NT-ThrCleav-2Rep (produzéiert 2Rep), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT (produzéiert NT), His-Thioredoxin-ThrCleav-CT (produzéiert CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (produzéiert NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produzéiert NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produzéiert NTF1Sp), a His-Ssulfur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (produzéiert NTMiSp).D'Konstruktioune goufen mat Thrombin (1:1000) verdaut an iwwer Nuecht bei 4 ° C. mat 20 mM Tris-HCl, pH 8, mat enger Spectra /Por Dialysemembran mat engem Molekulargewiicht Schwell vu 6-8 kDa dialyséiert.No der Dialyse gëtt d'Léisung op eng Ni-NTA Kolonn gelueden an d'Effluent mat dem Protein vum Interesse gesammelt.Protein Konzentratioune goufen duerch Miessung UV Absorptioun bei 280 nm mat der Ausstierwen Koeffizient vun all Protein ermëttelt, ausser NTF1Sp, déi de Bradford Assay no dem Hiersteller d'Protokoll benotzt.Rengheet gouf vun SDS polyacrylamide (4-20%) gel electrophoresis an Coomassie brillant blo staining bestëmmt.Proteine ​​goufen konzentréiert mat Zentrifugefilter (VivaSpin 20, GE Healthcare) bei 4000 xg mat engem 10 kDa Molekulargewiicht Cutoff an 20 Minutte Zyklen.
Thaw d'Proteinléisung a suergfälteg pipett 150 μl an eng 1 ml kloer Septum Fläsch (8 x 40 mm Thermo Scientific).D'Tuber goufen ofgedeckt a versiegelt mat Parafilm fir Verdampfung ze vermeiden.Echantillon (n = 3) sech bei 37 ° C oder 60 ° C incubated a periodesch ëmgedréint gelation ze observéieren.Echantillon, déi net geléiert goufen, goufen op d'mannst eng Woch inkubéiert.Reduzéieren NTMiSp Disulfid Obligatiounen mat 10 mM DTT pro 10 µM Protein.Fir d'Gelatioun vun natierleche Spann Seidbeschichtungen ze analyséieren, gouf d'schwedesch Bréckspinn geschnidden, déi zwee Haaptampulléiert Drüsen goufen an 200 μl 20 mM Tris-HCl Puffer pH 8 plazéiert a geschnidden fir datt d'Beschichtung vun den Drüsen trennt..D'Inhalter vun den Drüsen ginn a Puffer opgeléist, 50 μl fir d'Bestëmmung vum Trockengewiicht (duerch Inkubatioun vun oppene Fläschen bei 60 ° C bis konstant Gewiicht) an 150 μl fir Geléierung bei 37 ° C.
D'Messgeometrie / Tool ass aus Edelstol mat enger Parallelplack mat engem Top Duerchmiesser vun 20 mm an engem Spalt vun 0,5 mm.Erhëtzt d'Probe vu 25 ° C bis 45 ° C an zréck op 25 ° C mat enger Geschwindegkeet vun 1 ° C pro Minutt mat enger Edelstahl ënnen Peltier Plack.Vibrational Miessunge goufen op enger Frequenz vun 0,1 Hz an an der linearer viskoelastescher Regioun vum Material mat enger Belaaschtung vu 5% an 0,5% fir Proben vun 100 mg / ml respektiv 300-500 mg / ml gemaach.Benotzt eng personaliséiert Fiichtegkeetskammer fir Verdampfung ze vermeiden.Daten goufen analyséiert mat Prism 9.
Fir Infrarout (IR) Spektre bei Raumtemperatur vun 800 bis 3900 cm-1 ze sammelen.Den ATR-Apparat, wéi och de Liichtwee duerch de Spektrometer, gëtt virum a während dem Experiment mat trockener gefilterter Loft gesprengt.Léisungen (500 mg / ml fir d'Waasserabsorptiounspeaks an de Spektren ze minimiséieren) goufen op d'Kristalle pipettéiert, a Gelen (500 mg / ml) goufen virum Messung geformt an duerno an d'Kristalle transferéiert (n = 3).1000 scannt sech mat enger Resolutioun vun 2 cm-1 an null Flicht Zyklus opgeholl 2. Déi zweet Derivat war mat OPUS (Bruker) berechent engem smoothing Gamme vun néng Punkten.D'Spektra goufen an der selwechter Integratiounsregioun tëscht 1720 an 1580 cm-1 mat F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software" normaliséiert.An der ATR-IR Spektroskopie ass d'Penetratiounsdéift vun engem Infraroutstrahl an e Probe Wavennumber ofhängeg, wat zu enger méi staarker Absorptioun bei méi nidderegen Wellenzuelen resultéiert wéi bei méi héije Wellenzuelen.Dës Effekter sinn net korrigéiert ginn fir d'Spektra, déi a Fig.3 well se ganz kleng sinn (Ergänzungsbild 4).Korrigéiert Spektrum fir dës Figur goufe mat der Bruker OPUS Software berechent.
Prinzipiell ass eng ëmfaassend Quantifikatioun vu Proteinkonformatiounen méiglech no zouverlässeg Dekonvolutioun vun de Komponenten am Amid I Peak.Allerdéngs entstinn e puer Hindernisser an der Praxis.Kaméidi am Spektrum kann als (falsch) Peaks wärend der Dekonvolutioun optrieden.Zousätzlech fällt de Peak wéinst Waasserbéi mat der Positioun vum Amide I Peak zesummen a kann eng ähnlech Magnitude fir Proben hunn, déi eng grouss Quantitéit Waasser enthalen, sou wéi de wässerege Gel hei studéiert.Dofir hu mir net probéiert den Amide I Peak komplett ze zerstéieren, an eis Observatioune sollten nëmmen als Ënnerstëtzung vun anere Methoden wéi NMR Spektroskopie considéréiert ginn.
Léisunge vu 50 mg /ml NT a His-NT2RepCT goufen iwwer Nuecht bei 37 ° C geléiert.Den Hydrogel gouf duerno mat 20 mM Tris-HCl (pH 8) bis zu enger Konzentratioun vun 12,5 mg/ml verdünnt, gutt geschüttelt a pipettéiert fir de Gel ze briechen.Als nächst gouf den Hydrogel 10 Mol mat 20 mM Tris-HCl (pH 8) verdünnt, 5 μl vun der Probe gouf op e Kupfergitter mat Formvar beschichtet, an d'iwwerschësseg Probe gouf mat blottingpapier geläscht.D'Probe goufen zweemol mat 5 μl MilliQ Waasser gewascht a mat 1% Uranylformat fir 5 Minutten gefierft.Ewechzehuelen iwwerschësseg Fleck mat absorbéierend Pabeier, dann Loft dréchen de Mesh gemaach.Imaging gouf op dëse Gitter mat engem FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN operéiert bei 100 kV gemaach.D'Biller goufen op x 26.500 an x ​​43.000 Vergréisserungen opgeholl mat enger Veleta 2k × 2k CCD Kamera (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Däitschland).Fir all Prouf (n = 1), goufen 10-15 Biller opgeholl.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) gouf fir Bildanalyse a Miessung vu Glasfaserduerchmiesser (n = 100, verschidde Faseren) benotzt.Prisma 9 gouf benotzt fir onpaarte T-Tester (zwee-tailed) auszeféieren.Déi heeschen His-NT2RepCT an NT fibrils waren 11,43 (SD 2,035) an 7,67 (SD 1,389) nm, respektiv.D'Vertrauensintervall (95%) ass -4.246 bis -3.275.Fräiheetsgraden = 198, p < 0,0001.
80 μl flësseg Echantillon mat 10 μM Thioflavin T (ThT) goufen an triplicate gemooss (n = 3) ënner statesch Konditiounen benotzt Corning 96-gutt schwaarz ënnen kloer ënnen Placke (Corning Glass 3881, USA).Fluoreszenz Differenzen goufen opgeholl mat engem 440 nm Excitatiounsfilter an engem 480 nm Emissiounsfilter (FLUOStar Galaxy vu BMG Labtech, Offenburg, Däitschland).D'ThT Signal war weder gesättegt nach quenched, wéi Experimenter mat verschiddene Konzentratioune vun ThT goufen ouni d'Signal Intensitéit änneren.Rekord Absorptioun bei 360 nm fir Haze Miessung.Fir Aussaatexperimenter goufen 100 mg / ml Gele bei 37 ° C geformt, resuspendéiert a benotzt fir Aussaat bei molare Verhältnisser vu 5%, 10% an 20%.Daten goufen analyséiert mat Prism 9.
Thaw Stock vun His-NT2RepCT an NT>100 mg / ml op Äis a filtert duerch en 0,22 µm Filter.Konzentratioune goufen berechent andeems d'Absorptioun bei 280 nm mat Nanodrop gemooss gouf.A Wells vun enger 96-gutt schwaarz net-bindender Plack (Corning) mat engem klore Buedem, goufen Echantillon zu 20 mg /ml an 20 mM Tris-HCl pH 8 verdënntem a mat 5 μM ThT (endlech Konzentratioun), total Prouf Konzentratioun gemëscht. 50 l Volumen.Echantillon goufen all 10 Minutte bei 37 ° C op engem CellObserver (Zeiss) Mikroskop mat iwwerdroe Liichtkanal a FITC Excitatioun an Emissiounsfiltersets fir ThT Imaging gebildt.Eng 20x/0,4 Lens gëtt fir d'Bildgebung benotzt.Zen Blue (Zeiss) an ImageJ (https://imagej.nih.gov/) goufen fir Bildanalyse benotzt.Gels goufen och aus NT a His-NT2RepCT Léisunge bei enger Konzentratioun vu 50 mg /ml virbereet mat 20 mm Tris pH 8 a 5 µM ThT an inkubéiert bei 37 ° C fir 90 min.D'Gel Stécker goufen an eng nei Well mat 20 mM Tris, pH 8, a 5 μM ThT an engem net-bindender schwaarz 96 gutt kloer ënnen Plack transferéierte.Kaaft gréng Fluoreszenz an hell Feldbilder bei 20x / 0,4 Vergréisserung.ImageJ gouf fir Bildanalyse benotzt.
Léisung NMR Spektrum goufe bei 310 K op engem 600 MHz Bruker Avance Neo Spektrometer kritt, ausgestatt mat engem QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).NMR Proben enthalen 10 mg / ml homogene Protein markéiert mat 13C, 15N, opgeléist an 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Chemesch Verréckelung vun NT2RepCT um pH 6,7 goufen benotzt Peak 23 am 2D ​​Spektrum vun 15N-HSQC ze zouzeschreiwen.
Magiewénkel spannen zolidd NMR (MAS) Spektrum vun 13C, 15N-labeléiert Hydrogelen goufen op engem Bruker Avance III HD Spektrometer op 800 MHz opgeholl, ausgestatt mat enger 3.2 mm 13C / 15N {1H} elektronlos Sonde.D'Prouftemperatur gouf kontrolléiert mat engem variabelen Temperaturgasstroum bei 277 K. Zweedimensional Dipol-Rotatiounsresonanz (DARR) 76 a Radiofrequenzverbindung (RFDR) 77 Spektrum goufen op MAS-Frequenzen vun 12,5 kHz respektiv 20 kHz kritt.Kräizpolariséierung (CP) vun 1H bis 13C gouf mat enger linearer Rampe vu 60,0 bis 48,0 kHz bei 1H, 61,3/71,6 kHz bei 13C (bei 12,5/20 kHz MAS) a Kontaktzäit 0,5-1 ms gemaach.Spinal6478 Entkopplung bei 73,5 kHz gouf während Datensammlung benotzt.D'Acquisitiounszäit war 10 Millisekonnen an d'Zyklusverzögerung war 2,5 Sekonnen.Déi eenzeg verlinkte Cα /Cβ Korrelatiounen, déi an de RFDR Spektra observéiert goufen, goufen op Basis vun de charakteristesche Rescht-Typ chemesche Verschiebungen a multiplizéierte Korrelatiounen an den DARR Spektra zougewisen.
D'Zipper79 Datebank (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) gouf benotzt fir Fluttertendenzen a Rosetta Energie fir NT, NTFlSp an NTMiSp ze evaluéieren.D'Zipper Datebank berechent Rosetta Energy80, déi verschidde gratis Energiefunktiounen kombinéiert fir d'Proteinstruktur ze modelléieren an ze analyséieren.En Energieniveau vun -23 kcal/mol oder manner weist op eng héich Tendenz ze fibrilléieren.Déi méi niddereg Energie bedeit méi Stabilitéit vun den zwee β-Stränn an der Zipperkonformatioun.Zousätzlech gouf de Waltz Algorithmus benotzt fir amyloidogene Regiounen an NT, NTFlSp an NTMiSp Ref virauszesoen.81. (https://waltz.switchlab.org/).
D'NT Protein Léisung war gemëscht mat 2-(N-morpholino) Ethanesulfonic Seier (MES) Puffer um pH 5,5 an 6,0 de pH op pH 6 an 7 ze senken, respektiv.Déi lescht Protein Konzentratioun war 100 mg / ml.
Miessunge goufen op engem J-1500 CD Spektrometer (JASCO, USA) mat enger 300 μL Kuvette mat engem optesche Wee vun 0,1 cm gemaach.Proteinen sech op 10 μM (n = 1) an 20 mm phosphate Prellbock (pH 8) verdënntem.Fir Proteinstabilitéit an der Präsenz vu Salz z'analyséieren, goufen Proteinen an der selwechter Konzentratioun (n = 1) an 20 mM Phosphatbuffer (pH 8) mat 154 mM NaF oder NaCl analyséiert, respektiv.Temperatur Scans goufen op 222 nm vun 25 ° C bis 95 ° C mat enger Hëtzt Taux vun 1 ° C / min opgeholl.Den Undeel vun gebierteg gefaltet Proteinen gouf mat der Formel berechent (KDmeasure - KDfinal) / (KDstart - KDfinal).Zousätzlech goufen fënnef Spektra fir all Probe vu 260 nm bis 190 nm bei 25 ° C an no Erhëtzung op 95 ° C opgeholl.Fënnef Spektre goufen duerchschnëttlech, glat an ëmgewandelt an d'molar Elliptizitéit.Daten goufen analyséiert mat Prism 9.
D'fluorescence Intensitéit vun His-NT-GFP (300 mg /ml, 80 μL) war an triplicate gemooss (n = 3) an 96-gutt Corning Placke mat engem schwaarz transparent ënnen (Corning Glass 3881, USA) ënner statesch Konditiounen.Mooss Echantillon mat engem Fluoreszenz-baséiert Placke Lieser mat enger excitation Wellelängt vun 395 nm a Rekord der Emissioun op 509 nm virun gelation an 2 Stonnen méi spéit bei 37 ° C.Daten goufe mat Prism 9 analyséiert.
Purine Nukleosidphosphorylase Aktivitéit Assay Kit (fluorometric Method, Sigma Aldrich) gouf no den Instruktioune vum Hiersteller benotzt.Fir Aktivitéit a Gelen a Léisungen ze moossen, déi His-NT-PNP enthalen, mëschen 10 ng His-NT-PNP mat 100 mg / ml NT zu engem Gesamtvolumen vun 2 µL well de Gel e Signal iwwer dem Detektiounsintervall vum Set huet.Kontrollen fir gels a Léisungen ouni His-NT-PNP goufen abegraff.D'Miessunge goufen zweemol duerchgefouert (n = 2).Nodeems d'Aktivitéit gemooss gouf, gouf d'Reaktiounsmëschung ewechgeholl an de Gel fotograféiert fir sécherzestellen datt de Gel während der Messung intakt bleift.Daten goufen analyséiert mat Prism 9.
Fir méi Informatioun iwwer Studiedesign, kuckt d'Naturstudie Abstrakt verbonne mat dësem Artikel.
Figuren 1 an 2 presentéieren déi initial Donnéeën.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, a 6, Supplément Fig.3, Ergänzungsfig.5a, d, Zousazfig.6 an zousätzlech Fig.8. Daten Daten aus dëser Etude ginn an der Zenodo Datebank gehost https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.D'NMR Donnéeën, déi an dëser Etude kritt goufen, goufen an de BMRBig Repository ënner der Entrée ID bmrbig36 gepost.D'Strukturen vun GFP an PNP goufen aus PDB geholl (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. an Johansson, J. Spinning kënschtlech Spann Seid.National Chemesch.biologie.11, 309-315 (2015).
Babb, PL et al.Den Nephila clavipes Genom beliicht d'Diversitéit vu Spann Seid Genen an hire komplexe Ausdrock.National Genette.49, 895-903 (2017).